Biologia vegetale : nozioni fondamentali



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GENETICA

GENETICA = è la scienza che studia: STRUTTURA

FUNZIONE
EREDITARIETA’
del materiale genetico e della informazione genetica che esso porta.
STRUTTURA = Qual è il supporto fisico (la base) dell’informazione genetica;

equivale a dire com’è fatto il materiale che porta l’informazione genetica (MATERIALE GENETICO)


FUNZIONE = Quale tipo di informazione porta il materiale genetico e con quali modalità

questa informazione si esprime;


INFORMAZIONE GENETICA CARATTERE
EREDITARIETA’ = Come si trasmette l’informazione genetica:

- da cellula a cellula ( trasversalmente);


- da generazione a generazione ( verticalmente ).

Osservazione di partenza: non tutti gli organismi sono uguali. Tra i diversi organismi è

osservabile:


variabilità interspecifica ( procarioti – eucarioti; vegetali – animali; funghi – piante superiori; piante arboree – piante erbacee; graminacee – leguminose; frumento – mais; frumento duro – frumento tenero );
variabilità intraspecifica ( anche tra individui strettamente imparentati come tra

genitori e figli );


nell’insieme: esiste una diversità (variabilità) biologica di cui è responsabile la diversità (variabilità) dell’informazione genetica portata dai diversi organismi.

Origine della variabilità genetica:


modificazioni trasmissibili (ereditarie) e più o meno rilevanti del materiale genetico (informazione genetica) = mutazione;
riassetto del materiale genetico (informazione genetica) da una generazione alla successiva (assortimento casuale e crossing over) = ricombinazione.
Sulla variabilità che si origina agisce la selezione naturale innescando il processo della evoluzione.

Il materiale genetico deve quindi godere di alcune proprietà che devono essere compatibili con:


continuità delle caratteristiche specifiche (continuità della specie);
modificazioni evolutive.
Il materiale genetico deve perciò:
portare informazione biologicamente utile mantenuta in forma stabile (non deve essere soggetto a modificazioni frequenti);

consentire il mantenimento e la trasmissione fedele dell’informazione (da cellula a cellula e da generazione a generazione);

consentire che l’informazione genetica si esprima (possa essere tradotta) in carattere;

poter variare per consentire l’evoluzione (mutazioni, anche se non frequenti, e ricombinazione).


Fino agli anni ’40 si riteneva che le proteine potessero soddisfare a queste esigenze perché molecole complesse; questa loro caratteristica – la complessità strutturale – non era però sufficiente.


CENNI SULLA STRUTTURA DELLE MOLECOLE PROTEICHE.
AMINOACIDI = numero e tipo
STRUTTURA delle PROTEINE
primaria = sequenze aminoacidiche
secondaria = elica; configurazione
terziaria = legami H; forze di Van der Waals; legami disolfuro: - S – S-
quaternaria = dimeri e strutture più complesse; gruppi prostetici
Dalla configurazione assunta dalle molecole proteiche, determinata dalla loro struttura, dipende spesso la loro capacità di svolgere la funzione che è loro propria. Emblematico il caso delle proteine enzimatiche.
Dopo un serie di esperimenti condotti tra il 1928 e il 1953 fu raggiunta la conclusione che
IL MATERIALE GENETICO E’ COSTITUITO DAGLI ACIDI NUCLEICI E NON DALLE PROTEINE.

DNA: elementi essenziali


1 - molecola costituita da due strutture (eliche, nastri, filamenti) avvolte una sull’altra

in una configurazione più complessa che e’ la doppia elica.

2 - ogni elica e’ un polinucleotide (polimero): e’ formata da più nucleotidi tenuti insieme dai

legami fosforo – zucchero (legame covalente, stabile).

3 – un nucleotide è costituito da una molecola di zucchero a 5 atomi di carbonio (pentoso)

che, nel DNA, è il deossiribosio, un gruppo fosfato legato in posizione 5’ e una base azotata portata in posizione 1’.

4 - la successione fosforo – zucchero costituisce l’ossatura del polinucleotide e si sviluppa,

per ciascuna delle due eliche, con polarità 5’ - 3’ : le due eliche sono quindi antiparallele. Questo vuol dire che percorrendo una delle due eliche secondo una direzione (5’ 3’) l’altra viene percorsa nella direzione opposta (3’ 5’).

5 - su questa struttura, situata esternamente alla molecola, si inseriscono le basi azotate

adenina, guanina (basi puriniche o purine), timina e citosina (basi pirimidiniche o pirimidine) le quali si affacciano verso l’interno della doppia elica.

6 - tra purine ( A o G ) e pirimidine ( T o C ) di un’elica e le pirimidine e le purine,

rispettivamente, dell’elica antiparallela si stabiliscono dei legami a idrogeno che tengono unite le due eliche ( giustificazione della costanza del diametro della doppia elica).

7 – l’appaiamento tra purine e pirimidine non è casuale ma avviene secondo una

corrispondenza ben precisa e costante : Adenina – Timina ( A = T ) e Guanina –

Citosina ( G ≡ C ); il numero di legami è pari a due nel primo caso e a tre nel

secondo; l’unione tra Adenina e Timina è quindi meno stabile di quella tra Guanina e Citosina e, per essere rotta, richiede un minore dispendio di energia.

8\ - per quanto detto, le due eliche sono complementari e la successione delle basi

diun’elica determina la successione delle basi dell’altra. Questa rigida e, nello stesso tempo, variabile successione di basi (nucleotidi) lungo la molecola spiega sia la diversita’ dell’informazione genetica (determinata dalla successione delle basi lungo l’elica) sia la possibilita’ di mantenere inalterata tale informazione nel corso della divisione cellulare.
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Duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA è definita semiconservativa in quanto ciascuna delle due eliche da cui è costituita la doppia elica funge da stampo per la sintesi dell’elica complementare, dando così luogo alla formazione di due molecole complete (due doppie eliche) ciascuna delle quali è costituita da un’elica vecchia e da un’elica di nuova sintesi.


La duplicazione del DNA avviene secondo il modello sintetizzato qui di seguito:
1 – DENATURAZIONE E SVOLGIMENTO della doppia elica.

Proteina iniziatrice + DNA elicasi





Sequenza di origine idrolisi ATP energia per l’avanzamento
Forse 2 elicasi, una per l’elica LEADING (guida) e una per l’elica LAGGING (lenta)

2 – STABILIZZAZIONE del DNA a singola elica nella forca replicativa.


Proteine SSB (destabilizzatrici della doppia elica) (*)
(*) SSB proteins = Single Strand Binding Proteins: si uniscono alla singola

elica di DNA e ne stabilizzano la conformazione stesa in modo da renderla disponibile alla copiatura

3 – INIZIO DELLA SINTESI di un nuovo filamento di DNA
DNA elicasi + Primasi RNA Primer




Primosoma POLIMERASI III DNA
La necessità di mantenere inalterata la polarità 5’ – 3’ delle due eliche di nuova formazione fa si che la direzione di sintesi sia diversa sui due filamenti stampo.
Elica leading = sintetizzata nella direzione in cui si muove la forca di replicazione;
Elica lagging = sintetizzata in direzione opposta ( sintesi discontinua).

4 – ALLUNGAMENTO delle eliche di DNA di nuova sintesi.


La sintesi dell’elica leading avviene in maniera continua.

La sintesi dell’elica lagging avviene fino a che è disponibile DNA stampo. A questo punto il processo riprende sul tratto di DNA che nel frattempo si è svolto, previa sintesi di un nuovo primer di RNA ad opera della primasi e successivo intervento della Polimerasi III


5 – GIUNZIONE dei frammenti di Okazaki dell’elica lagging per formare un filamento

continuo; questa operazione avviene in due fasi:




  1. DNA Polimerasi I = continua l’azione della Polimerasi III che si è staccata e, contemporaneamente, rimuove dalla estremità 5’ del primer del frammento precedentemente formato i ribonucleotidi fino a lasciare un’interruzione di una base tra due nucleotidi adiacenti (azione esonucleasica 5’ – 3’ )



  1. DNA Ligasi che opera la saldatura dando luogo alla formazione di una unica molecola di DNA.

La trascrizione


Trascrizione = consiste nel trasferimento dell’informazione genetica da una sequenza di basi nel DNA ad una sequenza di basi nell’RNA.
E’ il primo dei due passi che costituiscono quello che Crick (1956) propose come Dogma Centrale della Biologia Molecolare:
Trascrizione Traduzione
DNA RNA PROTEINA

La trascrizione è anche il primo passo di quel processo che consente all’informazione genetica contenuta in ben definite sequenze di basi di tradursi in caratteri. La trascrizione è quindi indispensabile per consentire l’espressione genica.


La trascrizione interessa solamente una delle due eliche di DNA; per questo motivo, prima che la trascrizione inizi, la doppia elica di DNA si deve svolgere in una regione vicina al gene.
L’elica di DNA che viene trascritta prende il nome di elica stampo
Essa viene letta in direzione 3’ – 5’ in modo che il filamento di RNA possa essere sintetizzato in direzione 5’ – 3’.
Elica stampo e filamento di RNA (trascritto) hanno quindi polarità inversa.
L’RNA che viene sintetizzato ha invece la stessa polarità della seconda elica di DNA la quale prende il nome di elica codificante (5’ – 3’).
La trascrizione avviene ad opera di un enzima (RNA-polimerasi) il quale ha il compito di scegliere tra i ribonucleosidi trifosfati (ribonucleotidi) disponibili (ATP, GDP, CTP, UTP) quello che, di volta in volta, deve essere inserito in base al criterio di complementarietà con le basi presenti sull’elica stampo.
Tale criterio è analogo a quello già visto per la duplicazione del DNA, con la variante che la pirimidina Timina (T), complementare alla purina Adenina (A), viene sostituita dalla pirimidina Uracile (U). Perciò:
elica DNA stampo : 3’ – A T A C G A A G C – 5’ (trascritta)
trascritto di RNA : 5’ – U A U G C U U C G – 3’
elica DNA codificante : 5’ – T A T G C T T C G – 3’ (non trascritta)

Classi di RNA


Con la trascrizione vengono prodotti quattro tipi di RNA:

RNA messaggero (mRNA)

RNA di trasferimento (tRNA)

RNA ribosomale (rRNA)

RNA piccolo nucleare (snRNA) (solamente negli eucarioti; coinvolto

nel processamento dell’mRNA).

Solamente l’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in proteina. Gli altri RNA sono da vedere come “strumenti” della traduzione e funzionano come tali, svolgendo nella cellula compiti diversi.
L’mRNA deriva perciò dalla trascrizione dei cosiddetti “geni strutturali” o geni che codificano polipeptidi (PROTEINE).
Trascrizione dei geni strutturali
Un gene strutturale (che codifica per una proteina) può, in linea generale, essere suddiviso in:
- sequenza promotore, in posizione adiacente al punto di inizio della trascrizione, interagisce con RNA-polimerasi e segnala l’inizio della trascrizione;
- sequenza stampo, che viene trascritta dalla RNA-polimerasi in una sequenza di RNA a singola elica;
- sequenza terminatore, adiacente alla fine della sequenza stampo e che segnala la fine della trascrizione.
Il promotore è a monte e il terminatore è a valle del gene.

La trascrizione, almeno nei suoi tratti essenziali, è simile nei procarioti e negli eucarioti.





N.B. : Parlando di trascrizione, vengono spesso utilizzati i termini “a monte” e “a valle” facendo riferimento alle regioni situate nelle vicinanze dell’estremità 5’ o 3’, rispettivamente, del trascritto. L’uso di questi termini è giustificato dal fatto che la sintesi di RNA avviene sempre in direzione 5’ 3’. Le regioni a monte e a valle dei geni sono sequenze di DNA che codificano per i corrispondenti segmenti 5’ e 3’ dei loro trascritti, rispetto ad uno specifico punto di riferimento.

PROCARIOTI.


Inizio della trascrizione.
Nei procarioti sono identificabili 2 regioni a monte del punto di inizio:
-35 = 5’ – TTGACA – 3’

-10 = 5’ – TATAAT – 3’ (Pribnow o TATA box)


Per quanto detto nel N.B., queste due sequenze, definite anche come sequenze consenso, sono presenti in questa forma sull’elica codificante (non stampo) del DNA, mentre sull’elica stampo, che viene letta in direzione 3’ 5’, sono presenti come:
-35 = 3’ – AACTGT – 5’ e

-10 = 3’ – ATATTA – 5’ , rispettivamente.


La sequenza a –35 viene anche definita come sequenza di riconoscimento.
L’inizio della trascrizione si ha quando l’RNA-polimerasi si lega al promotore il quale comprende entrambe le sequenze consenso a –35 e a –10; l’operazione avviene in fasi successive:


  1. la RNA-polimerasi oloenzima (*) si lega in modo lasco alla sequenza –35. Il DNA è a doppia elica chiusa.




  1. la RNA-polimerasi si lega più strettamente al DNA. Si ha uno svolgimento di 17 coppie di basi della doppia elica (denaturazione) in corrispondenza della sequenza –10 che è tutta costituita da coppie di basi A=T con due legami.




  1. La RNA-polimerasi si orienta per iniziare la trascrizione del primo nucleotide situato a valle della sequenza promotore.

(*) L’enzima RNA-polimerasi è formato da quattro catene polipeptidiche e da un quinto polipeptide (il fattore ) il quale ha la funzione specifica di riconoscere il promotore.


N.B. = I promotori possono avere sequenze diverse. Come conseguenza, l’efficienza con la quale l’RNA-polimerasi si lega varia a seconda del promotore e il tasso di inizio della trascrizione non è costante. Ciò spiega perché geni diversi abbiano tassi di espressione differenti a livello di RNA. (Una sequenza 5’ – GATACT –3’ in –10 ha un tasso di trascrizione più basso rispetto a 5’ – TATAAT –3’)

In E. coli, oltre a promotori diversi, sono anche stati individuati fattori differenti che intervengono nella regolazione dell’espressione genica.

Allungamento della catena di RNA.


Alla bolla di trascrizione (DNA denaturato), dopo la polimerizzazione di 8 o 9 ribonucleotidi, il fattore  si dissocia dal nucleo enzimatico e può essere riutilizzato in un’altra molecola di RNA-polimerasi.
In corrispondenza del tratto di doppia elica denaturato si forma quello che viene chiamato un ibrido DNA – RNA per indicare la breve regione in fase di trascrizione, compresa nella bolla di trascrizione, nella quale l’elica stampo che viene trascritta e il filamento di RNA in fase di sintesi rimangono temporaneamente appaiate
Il nucleo enzimatico (core) completa la trascrizione avanzando lungo la doppia elica di DNA.
La molecola di RNA-polimerasi contiene sia l’attività svolgente sia quella riavvolgente il DNA. Essa svolge continuamente la doppia elica di DNA a valle del sito di polimerizzazione e riavvolge i filamenti di DNA complementari a monte, non appena si sposta lungo la doppia elica.
In E. coli, la lunghezza media di una bolla di trascrizione è di 18 paia di basi e, in una catena di RNA in crescita, vengono incorporati circa 40 ribonucleotidi al secondo.
La distensione (srotolamento) della doppia elica di DNA ad una estremità è compensata, all’altra estremità dal suo superavvolgimento negativo, provocato dalla topoisomerasi I.
Terminazione della trascrizione
La fine della trascrizione è segnalata da elementi di controllo detti terminatori dei quali, in E. coli, possono essere:
 dipendenti = vengono riconosciuti da un fattore  (rho) (proteina con funzioni enzimatiche) che si associa al core della RNA-polimerasi e destabilizza l’ibrido DNA-RNA;
 indipendenti = vengono riconosciuti direttamente dal core dell’enzima.
In entrambi i casi, la sintesi di RNA si blocca, l’RNA sintetizzato si allontana, l’RNA-polimerasi si stacca dal DNA.
Nei procarioti la sintesi di tutti i trascritti di RNA (mRNA, tRNA, rRNA) è opera di un’unica RNA-polimerasi.
Le molecole di RNA appena trascritte (trascritti primari) non sono separate dal sito di sintesi proteica da una membrana nucleare. Quindi, una volta sintetizzata l’estremità 5’ di un mRNA, essa può essere subito utilizzata come stampo per la sintesi polipeptidica.
In maniera analoga, una volta che la molecola di mRNA sia stata utilizzata per la traduzione, può essere demolita a partire dall’estremità 5’.
Pertanto, la trascrizione, la traduzione e la demolizione dell’mRNA, nei procarioti, possono avvenire spesso contemporaneamente.

EUCARIOTI


Negli eucarioti la trascrizione avviene per opera di 3 diversi tipi di RNA-polimerasi, localizzati diversamente e con funzione differenziata:

RNA-polimerasi Localizzazione Prodotti


I nucleolo RNA ribosomali (rRNA)

28S; 18S; 5,8S


II nucleo Pre - mRNA nucleari+ alcuni snRNA
III nucleo tRNA; rRNA 5S; i rimanenti snRNA

N.B. = I valori numerici con i quali si distinguono i diversi tipi di rRNA indicano il numero di Unità Svedberg che servono ad indicare, sinteticamente, le dimensioni, il peso molecolare, la densità delle diverse molecole di rRna separate per centrifugazione in gradiente di saccarosio. Di tali frazioni si misura, cioè, il tasso di sedimentazione che viene opportunamente convertito in Unità Svedberg (o valore S) per mezzo di una formula.



Le tre RNA polimerasi, per dare inizio alla trascrizione, richiedono l’intervento di altre proteine , dette fattori di trascrizione, le quali hanno il compito di riconoscere il promotore e, legandosi a questo, favorire l’aggancio dell’enzima.

Regolazione della trascrizione


La trascrizione , in particolare quella dei geni strutturali, è un processo regolato, che avviene sotto il controllo di molecole diverse che interagiscono con i cosiddetti elementi di regolazione: sequenze coinvolte nella regolazione della trascrizione facenti parte del gene strutturale e che possono essere situate sia a monte che a valle del punto d’inizio della trascrizione.

Questi elementi regolatori possono essere organizzati in maniera peculiare per numero, tipo e disposizione sul DNA, in combinazioni di elementi regolatori positivi, che attivano la trascrizione, o negativi, che la reprimono.


A questi elementi di regolazione possono legare fattori di trascrizione (TF) specifici, richiesti per l’inizio della trascrizione, e fattori di regolazione, cioè proteine coinvolte nell’attivazione o repressione della trascrizione.
Questi elementi di regolazione sono generalmente localizzati entro poche centinaia di basi dal sito d’inizio della trascrizione, ma vi sono elementi regolatori posti anche a 1000 e fino a 30.000 paia di basi dal sito d’inizio.
La regione regolatrice posta nelle immediate vicinanze del punto d’inizio della trascrizione costituisce il promotore, mentre quelle più lontane sono i cosiddetti enhancers (intensificatori).
Gli elementi del promotore in un gene strutturale eucariotico sono rappresentati da:
TATA box (elemento TATA = Goldberg – Hogness box). Ha sequenza consenso 5’ – TATAAA – 3’ ed è posto a –30;
CAAT . Ha sequenza consenso 5’ – CGCCAATCT – 3’ ed è generalmente situato a

–80, ma funziona anche se situato in altri punti più o meno distanti;


GC . Ha sequenza consenso 5’ – GGGCGG - 3’. Può essere presente in più copie orientate in maniera diversa.
Se gli elementi promotori sono essenziali per l’inizio della trascrizione, gli enhancers sono importanti per intensificare la trascrizione stessa. Essi possono avere orientamento diretto o inverso rispetto al gene e possono essere collocati anche a notevole distanza dalla sequenza che deve essere trascritta
Perché l’enhancer possa far sentire la sua azione, il DNA deve ripiegarsi, in modo che la sequenza enhancer si trovi vicina al promotore.
Accanto agli elementi di intensificazione (enhancers) si riscontrano anche elementi silenziatori (silencers).
Maturazione dell’mRNA
Negli Eucarioti, la trascrizione produce una molecola di RNA (pre-mRNA o trascritto primario o m-RNA precursore) che è molto più lunga di quella che passerà dal nucleo al citoplasma per essere tradotta (mRNA maturo). Il pre-mRNA è infatti costituito dalla trascrizione di introni (sequenze non codificanti) e di esoni (sequenze codificanti).
Per poter essere trasferito dal nucleo al citoplasma ed essere tradotto, il pre-mRNA deve andare incontro a modificazioni post-trascrizionali (maturazione o processamento) come di seguito indicato:
- alla estremità 5’ viene aggiunto un cappuccio (CAP) mediante l’operazione di “capping”, cioè l’aggiunta di una GUANINA metilata e di due gruppi metilici (CH3) ai primi due nucleotidi;
- alla estremità 3’ viene aggiunta una sequenza di 50 – 250 adenine (Poly A) in prossimità della sequenza AAUAAA posta 10 – 30 nucleootidi a monte del sito di attacco;
- gli introni vengono eliminati mediante l’operazione di “splicing”, gli esoni adiacenti vengono legati insieme per formare la molecola continua di mRNA che sarà tradotta.



Esone 1

I

Esone 2

I

Esone 3

I

Esone 4


Esone 1

Esone 2

Esone 3

Esone 4



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