Cromatografia



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02.06.2018
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Cromatografia

  • Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo

  • Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa

  • Le tecniche sono molto utilizzate in campo archeometrico, essendo particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica



Nascita della cromatografia

  • inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett.

  • Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed eluì, (cioè versò in continuo) con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla



Cenni preliminari

  • Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive (anche se in senso strettamente analitico possono in alcuni casi essere non distruttive), in quanto operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore: i materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente.

  • Non è possibile l’analisi senza prelievo di campione né tanto meno l’analisi in situ (tranne con strumenti miniaturizzati)

  • è bene precisare che il consumo di campione è minimo. Sono sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a pochi mg di campione solido



Basi del procedimento cromatografico

  • il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico

  • la fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che immiscibile nell’eluente

  • la fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana

  • la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi

  • i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema

    • i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente
  • la separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione Kd=Cs/Cm)



Visualizzazione della separazione

  • Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluito (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma

  • La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione

  • L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo



Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.

  • Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.



Tempo di ritenzione

  • Oltre al tempo di ritenzione tR, è possibile quantificare l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi:



Piatti teorici

  • Il sistema cromatografico è immaginato come una colonna composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teorici;

  • in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna è dovuto all’azione dinamica della fase mobile



Separazione ottimale

  • separazione con scarsa risoluzione e basso N

  • migliora la risoluzione ma è sempre basso N

  • ottima risoluzione e buono N



Interazione soluto-fasi

  • Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

  • In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico



Meccanismi della separazione

  • In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:



Adsorbimento

  • La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile



Ripartizione

  • La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili.

  • Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile



Scambio ionico

  • La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)



Esclusione dimensionale

  • La fase stazionaria è un solido poroso o un gel.

  • Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi



Affinità

  • In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC)





Stato fisico della fase mobile

  • Cromatografia Liquida (LC): la fase mobile è un liquido nel quale siano solubili i componenti della miscela da separare; la fase stazionaria deve essere insolubile nella fase mobile

  • Gascromatografia (GC): la fase mobile è un gas che funge da carrier per i componenti della miscela

  • Cromatografia fluida supercritica (SFC): la fase mobile è un fluido supercritico, con proprietà intermedie tra un liquido e un gas



Forma del letto cromatografico

  • Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può riempire completamente (colonna impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare)

  • Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC)



Tecniche cromatografiche

  • In base alla forma del letto cromatografico

    • Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)
    • Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
  • In base allo stato fisico della fase mobile

    • Cromatografia Liquida (LC)
    • Gascromatografia (GC)
    • Cromatografia fluida supercritica (SFC)
  • In base al meccanismo di separazione

    • Adsorbimento
    • Ripartizione
    • Scambio ionico
    • Esclusione
    • Affinità


Cromatografia liquida

  • La cromatografia liquida è impiegata per la separazione di sostanze non volatili, neutre o ioniche, e di sostanze termolabili. Si presta facilmente a misure quantitative. Si possono separare sostanze appartenenti a varie classi tra cui, di interesse archeometrico:

  • aminoacidi, peptidi e proteine

  • idrocarburi

  • carboidrati

  • terpenoidi

  • ioni inorganici



Cromatografia planare

  • L’esecuzione dell’analisi è molto semplice: la miscela da separare va depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su una linea che segna l’inizio del processo di eluizione



Cromatografia planare



Cromatografia planare

  • Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire effettuando separazioni su miscele standard; in questo caso il parametro che caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di ritardo. Per ogni analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente:

  • Rf = danalita / deluente

  • Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1.

  • I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8



Visualizzazione dei risultati

  • Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due metodi per visualizzare il risultato della separazione:



Irraggiamento con UV



Addizione di reagenti cromogeni

  • Nell’immagine sotto è mostrato un contenitore per l’aspersione di ninidrina su lastrine TLC o PC

  • Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per evidenziare le macchie sono riportati nella tabella sottostante



Cromatografia planare bidimensionale

  • Per aumentare la separazione tra gli analiti e quindi la loro identificazione è possibile effettuare l’eluizione lungo due dimensioni, prima lungo un asse e poi, girando a 90° la lastrina, lungo l’asse ortogonale, evenutalmente con una fase mobile differente: in questo modo le macchie sono separate in maniera più efficiente

  • Sotto: separazione di aminoacidi



Esempio: pigmenti fogliari

  • Nella figura è mostrata la separazione per cromatografia su carta orizzontale di pigmenti fogliari da un estratto della pianta Cisto bianco; si tratta dei pigmenti che fanno cambiare il colore delle foglie nelle diverse stagioni. La separazione è ottenuta con un disco di carta da filtro come fase fissa e alcol etilico al 95 % come fase mobile. Gli aloni sono attribuiti alle diverse sostanze sulla base del loro comportamento chimico: le sostanze più idrosolubili (e quindi più affini all’acqua adsorbita sulla cellulosa, che costituisce la fase fissa) sono quelle al centro, cioè clorofille A e B; le sostanze meno idrosolubili, xantofilla e carotina, migrano all’esterno in quanto più affini alla fase mobile



Separazione di coloranti porpora

  • Separazione per PC di estratti in etanolo da molluschi



Cromatografia liquida su colonna

  • I primi esperimento di cromatografia su colonna utilizzavano colonne di vetro di 1-5 cm di diametro e lunghezza fino a 5 metri. Ciò richiedeva tempi diseparazione molto lunghi

  • Attualmente è possibile realizzare microcolonne di pochi cm di lunghezza, in grado di separare in pochi minuti molte sostanze. Queste colonne sono costituite da particelle di 1-5 µm di diametro, che richiedono pressioni molto alte per forzare il passaggio della fase mobile attraverso la colonna. Per sistemi di questo genere il termine utilizzato è cromatografia liquida ad elevate prestazioni o elevate pressioni (HPLC, High Performance o Pressure Liquid Chromatography)



Strumentazione per HPLC

  • Un cromatografo HPLC è costituto dalle seguenti parti:



Rivelatori per HPLC

  • Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti

  • Solute properties: si misura una caratteristica del soluto

  • QUINDI:

  • Spettrofotometrico UV-visibile: il più comune (quasi tutte le sostanze assorbono nell’UV-vis), misura l’assorbanza dell’eluito a  fissa

  • Spettrofotometrico UV-visibile con Diode-array: misura l’assorbanza dell’eluito in un range di , restituendo in ogni istante lo spettro UV-vis

  • Spettrofotometrico IR: poco diffuso

  • Spettrofluorimetrico: solo per sostanze che fluorescono (anche con derivatizzazione), molto più sensibile dell’UV-vis

  • a Indice di rifrazione: utilizzato per zuccheri o sostanze non attive nell’UV-vis

  • Elettrochimico: misura la corrente generata ad un elettrodo sul quale avviene una reazione redox che coinvolge l’analita: adatto per sostanze elettroattive, sensibilità eccellente

  • Conducimetrico: misura la corrente trasportata da ioni presenti nell’eluito, utile per sostanze ioniche o ionizzabili

  • Spettrometria di massa: la nuova frontiera, fornisce in ogni istante lo spettro di massa dell’eluito



Coloranti per arazzi



Cromatografia ionica



Applicazioni della IC



Separazione di amminoacidi



Gascromatografia





Gascromatografia

  • Gas-liquido

    • supporto inerte solido
    • liquido non volatile, legato covalentemente
    • meccanismo di ripartizione
    • moltissime applicazioni
  • Gas-solido

    • fasi stazionarie di silice, allumina o carbone
    • meccanismo di adsorbimento
    • adatta per la separazione di gas permanenti (H2, He, Ar, O2, N2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione


Riassumendo

  • analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici

  • Gascromatografia

  • analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili

  • Cromatografia liquida







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