Istruzione operativa sezione acidi nucleici con metodiche commerciali



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ISTRUZIONE OPERATIVA

SEZIONE ACIDI NUCLEICI CON METODICHE COMMERCIALI


IOS.02.2.2A

REV.4 DEL 09/08

DETERMINAZIONE QUALI-QUANTITATIVA DELL’RNA DI HCV




INDICE

1.Scopo 2

2.Campo di applicazione 2

3.Responsabilità 2

4.Modalità esecutive 2

5.5 Procedura di chiusura dell’ampliprep: 10

5.6 Manutenzione giornaliera su Ampliprep: 10

5.7 Manutenzione periodica degli strumenti ampliprep e TaqMan: 11

5.8 Modalità esecutive delle urgenze 11

5.9 Criteri di validazione e interpretazione dei risultati 12




Note Ultima Revisione

Le modifiche apportate riguardano l’inserimento della procedura per l’uso del TaqMan 9600 e l’inserimento delle modifiche specifiche per le procedure di urgenza.





Redatto da

Verificato da

Approvato da

Funzione:

Funzione:

Funzione:

Data:


Firma:

Data:


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Firma:


1.Scopo


La determinazione della carica virale di HCV-RNA viene utilizzata nella pratica clinica per la diagnosi dell’infezione acuta e cronica dell’epatite C. L’uso di un test con ampio range dinamico ed elevata sensibilità (15 UI/ml) consente di poter utilizzare un unico test per la determinazione sia qualitativa che quantitativa da applicare in tutte le fasi essenziali per la diagnosi dell’infezione da HCV ed il monitoraggio della risposta terapeutica.

2.Campo di applicazione


Il test per la determinazione della carica virale di HCV trova applicazione nella diagnosi di infezione attiva da HCV e nel monitoraggio della terapia anti-HCV (sez.02.02.2)

3.Responsabilità


Biologo dirigente:

Interpretazione dei risultati, validazione e stampa.



Operatore tecnico:

Esecuzione test, manutenzione degli strumenti, inserimento dati



4.Modalità esecutive


L’esecuzione del test prevede una fase preliminare di estrazione automatizzata eseguita su Ampliprep, l’estratto viene quindi retrotrascritto ed amplificato mediante real time PCR, il controllo dell’estrazione e dell’amplificazione avviene grazie alla presenza di un controllo interno che subisce lo stesso percorso analitico del campione in esame. Il saggio viene eseguito su siero, i campioni ematici pervenuti in laboratorio vengono centrifugati a 3000 rpm per 20 minuti, stoccati in apposite provette eppendorf da 2 ml e congelati a -20°C.
Giornalmente viene stampato il piano di lavoro comprendente le seguenti determinazioni: HCV-RNA quali-quantitativo e genotipo-HCV.

Dopo aver preparato la lista di lavoro si procede alla selezione dei campioni ed allo scongelamento degli stessi. Durante lo scongelamento dei campioni si procede alla prepararazione degli strumenti. Di seguito sono elencate e descritte in successione le varie fasi, che devono essere rigorosamente rispettate per l’avvio e l’esecuzione di una lista di lavoro.


4.1 Procedura di accensione dello strumento TaqMan 4800 CB1:


Accendere il PC e l’ampliprep, quando lo richiede digiare CTRL-ALT-DEL

comparirà la scritta USER ID e PASSWORD digitare per due volte aluser, cliccare su amplilink 2.41 per 2 volte e attendere l’inizializzazione dell’ampliprep, comparirà una finestrella con USER ID, digitare PCR e a password PCR, dare invio.
A destra del monitor ci sono 7 icone:

1)La prima icona indica i messaggi che ci inviano gli strumenti: se l’omino è grigio e dritto non ci sono nuovi messaggi, se cammina ci sono nuovi messaggi. Il colore dell’omino ci dà informazioni inerenti l’entità dell’errore: la colorazione gialla indica che l’errore non è grave e consente comunque di lavorare, se la colorazione è rossa l’errore è fatale. Cliccando sull’omino si entra in new message: per archiviarli selezionarli e cliccare confirm, poi yes se è uno, all se sono due o più. Tali messaggi saranno archiviati in message log.

2) La seconda icona indica lo stato in cui si trovano gli strumenti collegati al PC ed il tempo necessario per l’esecuzione dei test, ci consente inoltrre di collegarci all’ampliprep oppure al TaqMan.

3) La terza icona indica lo stato (system) dello strumento:

per l’ampliprep il n° SPUs, il n° k-tips, i K-carriers, la temperatura, lo scarico, il livello dei tamponi. Se lo strumento selezionato è il cobas TaqMan 48 si visualizzerà lo stato dello strumento con informazioni sulle due stazioni di amplificazione (TCA e TCB).

4) La quarta icona è denominata Order: serve per creare la lista di lavoro, tale lista può essere creata manualmente oppure mediante interfacciamento al PC centrale del laboratorio.

5) La quinta icona è quella dei risultati: selezionando la lista di lavoro che ci interessa si può accedere ai risultati. Si possono inoltre visualizzare, cancellare e archiviare le sedute, per cancellare ed archiviare , si clicca su accept, poi di seguito su File, su Archive, Selection, si digita l’identificativo della seduta, salvare, password, ok, si clicca sul simbolo delete (in alto).

6) Icona della Configurazione, questa icona indica tutte le analisi che si eseguono con l’ampliprep, di solito non viene utilizzata.

7) Memo: si utilizza per lasciare dei messaggi. E’ bianca se non è stato lasciato alcun messaggio, blu se c’e’ un messaggio, rossa se il messaggio è urgente.
4.2 Manutenzione giornaliera su Ampliprep (TaqMan 4800) : la manutenzione deve essere eseguita giornalmente prima di avviare la seduta e prevede la seguente procedura:

selezionare lo strumento che ci interessa e poi cliccare su service due, appare daily maintainance e normal prime, evidenziare con shift e : cliccare perform e next, l'ampliprep muoverà i transfer. Attendere il passed e poi next: se necessario cambiare la tanica di scarico.

Next: pulire la piattaforma (tutta la superficie nera), con un Kimberly-Clark o scottex imbevuto di alcool a 70 °,poi asciugare.

Next: pulire le posizioni di inizializzazione (le 2 torrette di metallo) con acqua deionizzata e poi asciugare.

Next: l'ampliprep muove i transfer al centro, pulire i sensori con alcool (tutte le parti verdi in prossimità dei led rossi (questi ultimi si puliscono con acqua distillata) ed il parallelepipedo nero sul transfer di sinistra che reca una lente nella parte interna), asciugare.

Next: aprire il cassetto bianco in basso (allo strumento) ed ispezionare tubi e siringhe.

Next: verificare che non ci siano perdite o bolle di aria.

Next: finish.

L'ampliprep eseguirà il prime.
4.3 Caricamento dei campioni (TaqMan 4800):
-Prendere un rack portacampioni, le bandierine con bare-code e provettine trasparenti (in ogni sacchetto c'è il n° necessario per 24 campioni).

- Inserire le bandierine con il bare-code, che consentono di riconoscere i campioni e i controlli, in ognuna delle 24 posizioni del rack porta-campioni e inserire le provette corrispondenti.

- Le provette di siero scongelate vanno numerate da 1 a 22, le posizioni 23 e 24 corrisponderanno ai due controlli: negativo e positivo presenti in ogni Kit di estrazione.

-Vortexare i sieri e i controlli e distribuirli nelle rispettive provette. Per l’esecuzione del test quantitativo dispensare 1100 µl.

-Controllare che nelle provette non ci siano bolle d'aria, che i tappini non siano avvitati troppo stretti e che venga rispettato il giusto avvitamento intorno alla filettatura.

-Caricare il rack portacampioni indifferentemente dalla posizione F alla H.



4.4 Caricamento dei reattivi (ampliprep;TaqMan 4800):
Aprire lo sportello superiore bianco e caricare: nella posizione A il portareagenti con le biglie, indifferentemente dalla posizione B alla E caricare il portareagenti con il lysis e le sonde, dalla posizione J alla L le SPU (le vaschette dove verrà processato il campione), ed infine alla posizione M e N i K-tips (puntali) nelle posizioni O e P inserire i K- carriers mediante l’apposito rack, da monitor posizionarsi su samples e leggere con l’apposita pistola il bare-code del rack ed entro pochi secondi quello del K-carrier. Verificare lo spostamento del K-carrier nel proprio alloggiamento (LP e/o RP).

Sul frontale dell’ampliprep sono situati degli indicatori dello stato funzionale dello strumento (Led). La colorazione verde indica che lo strumento è pronto per l’uso, la colorazione arancio può indicare lo stato di pausa, l’avvenuta esecuzione dei test impostati, oppure la possibilità di togliere rack vuoti , la colorazione rossa può indicare un errore oppure l’impossibilità di togliere dei rack perché sono in uso.


Dall’icona system: la digitazione di cassett/sample ci consente di controllare i reattivi caricati ed i 24 campioni. Ritornare a system e controllare i simboli reservoir 1 e 2, che indicano il livello dei tamponi, se necessario sostituirli.

Dalla stessa videata verificare che le temperature siano nel range e premere START per avviare l'estrazione. Se carichiamo 48 campioni, dopo la programmazione della lista di lavoro relativa ai primi 24, introdurre i successivi 24 campioni, preparare la seconda lista di lavoro, a questo punto lo strumento partirà automaticamente.

Sulla sinistra del video apparirà l'ora di fine estrazione, circa 2 ore per 24 campioni, e 3 ore per 48.

Al termine dell'estrazione il led, in corrispondenza della posizione dei campioni, diventerà arancione.




4.5 Amplificazione (TaqMan 4800) :

I campioni ed i controlli estratti devono essere amplificati entro due ore dall’estrazione. Estrarre il rack che trasporta i K-carrier dall’ampliprep, con l’apposito K carrier capping tools (apposita pinza per K carrier), posizionare il K-carrier nello strumento COBAS TaqMan. Il posizionamento del K-carrier si può eseguire da monitor cliccando su open oppure direttamente sullo strumento schiacciando l’apposito pulsante situato nella parte anteriore dello strumento.

Far partire l’amplificazione digitando start.

Dopo 1 ora e trenta si otterranno i risultati, questi dovranno essere stampati selezionando dall’icona risultati la seduta che ci interessa, digitare accept e stampare i risultati. Quando ad un campione compare la scritta Q_QS_INVALID, stampare il grafico ciccando su measurament details. A questo punto la seduta si può archiviare come descritto sopra.


Per il recupero degli amplificati aprire l’apposito sportello come descritto sopra , chiudere lo sportello e spegnere lo strumento.

Gli amplificati TaqMan vanno numerati alla fine di ogni seduta e posti all’interno di apposite scatole per la conservazione.

La numerazione delle provettine contenenti l’amplificato (K-tubes), deve seguire lo schema di pipettamento del K-carrier di seguito riportata

Schema di pipettamento del K-carrier


23

19

11

15

22

13

5

3

8

18

9

1



2

10

17

7

4

6

14

21

16

12

20

24

In ogni scatolina mettere 2 sedute TaqMan, e numerarle con colori indelebili differenti.



4.6 Procedura di chiusura dell’ampliprep (TaqMan 4800) :
-Sul monitor selezionare lo strumento ampliprep.

-Togliere i reattivi ed il materiale monouso utilizzato dallo strumento, accendere gli UV per 30 minuti. L’accensione degli UV va fatta dal monitor digitando sull’icona service, di seguito service all, selezionare start UV light, digitare perform e poi next. Spegnere l’ampliprep.

Qualora volessimo chiudere tutto il sistema (amplilink 2.41) procedere come segue, ma solo se sono stati ottenuti i risultati dal TaqMan.


-Cliccare file, shut down, yes. Alla chiusura cliccare start, in basso a destra, di nuovo shut- down, yes, apparirà la scritta restart, spegnere il computer e poi l’ampliprep.

-Se si procede con una nuova estrazione, lo strumento si deve lasciare acceso, ma la procedura di spegnimento deve essere eseguita il mattino successivo.



4.7 Manutenzione periodica degli strumenti ampliprep e TaqMan (TaqMan 4800).
La manutenzione dell’ampliprep richiede il cambio dei filtri Hepa (ogni 3 mesi), il cambio delle guarnizioni, del gripper (la pinza che si trova sui transfer), il cambio gli aghi, degli stantuffi delle siringhe o se necessario della siringa in toto. Le lampade U.V. si cambiano ogni 6 mesi circa e comunque lo strumento ne indica il consumo. Per quanto riguarda il TaqMan, la manutenzione consiste nello spolverare due volte a settimana lo strumento, e quando è richiesto eseguire il cambio della lampada e dei filtri. Pulire con alcool al 70 % sia esternamente che sotto il coperchietto.
4.8 Blocco di amplilink: Digitare CTR-ALT-DEL, TASK MANAGER, si apre WINDOWS-NT TASK MANAGER, cliccare su TASK con il tasto destro del mouse, si apre una mascherina, cliccare su END TASK. Appare Amplilink 2.41 cliccare END TASK. Chiudere WINDOWS-NT TASK MANAGER dal simbolo X situato in alto. Rientrare in amplilink 2.41.
4.9 Trasmissione dei risultati (TaqMan 4800)


  • Aprire Wif sul computer vicino alla cappa

  • Dalla botticella di SN ricevere ordini dall’accettazione (selezionare HCV, dal giorno/al giorno, anche esami già letti, esegui)

  • Aprire la cartellina gialla e selezionare HCV

  • Eliminare tutti i pazienti che non si desiderano trasmettere e poi cliccare applica; chiudere da X (importante: se ci sono 2 liste di lavoro nella stessa giornata selezionare tutti i 44 pazienti e poi trasmetterli tutti insieme)

  • Cliccare su HCV->1-DxALink (icona in basso a Dx)

  • Cliccare su T di trasmetti ordini

  • Alla fine della trasmissione andare sul computer dell’ampliprep e posizionarsi su order, sample rack, new: nel campo sample rack ID mettere il n° del sample rack che si vuole utilizzare, nel campo batch ID mettere il n° di seduta CQ e la data del giorno che si esegue, nel campo comment mettere il n° del lotto HCV Taqman che si sta utilizzando, nel campo sample ID cliccare 2 volte con il tasto Sn del

  • mouse; appariranno i campioni trasmessi. Di questi solo il primo è evidenziato: tenere premuto shift e ↓ ed evidenziare tutti i campioni fino al n° 22 della seduta. Cliccare ok. I campioni verranno trasferiti sul sample rack. Mettere in 23 il ctr neg cliccando 2 volte con il tasto Sn del mouse in pos 23 sul simbolo S e selezionando NC ed in 24 il ctr low pos facendo la stessa operazione e selezionando LPC. Infine salvare la lista di lavoro con save (in basso a Dx). Se si deve eseguire un’altra lista di lavoro ripete la stessa operazione a partire da sample rack, new…….

  • La mattina successiva: scaricare il k-carrier dal Taqman, sul computer dell’ampliprep andare sull’icona risultati (quella con l’occhiolino), evidenziare la seduta di interesse e cliccare accept (in basso a dx)

  • Aprire Wif, cliccare HCV->1-DxALink ( in basso a Dx) e dall’icona R ricevere i risultati.

  • Dopo la ricezione aprire la cartellina gialla, selezionare HCV, modificare il risultato dei campioni che durante la prima giornata sono stati diluiti, spuntate il primo campione nel campo ok, e poi sulla scritta ok, cosicché tutti i campioni verranno spuntati in automatico; cliccare applica.

  • Cliccare sulla botticella di Dx (trascrivi i risultati sui referti) e cliccare esegui

  • Andare in Wlab e da risultati selezionare stampa di controllo, scegliere epatite C biologia molecolare, mettere la data dei campioni che sono stati lavorati, stampare e numerare il piano di lavoro con il N° del campione nella seduta ed il N° della seduta eseguita.



5. COBAS TAQMAN 9600 CB2

La maggior parte delle fasi che consentono il funzionamento del TaqMan 4800 sono identiche a quelle del 9600, pertanto verranno riportate di seguito solo le differenze.

Posizionarsi nel WLab del compiuter adiacente al Cobas 9600, dopo aver preparato la lista di lavoro da WIF CLICCARE SULL’ICONA chiudere le connessioni che si aprono automaticamente e aprire la connessione HCV2/ Cobas 2, si procede alla selezione dei campioni ed allo scongelamento degli stessi. Durante lo scongelamento dei campioni si procede alla preparazione dello strumento. Di seguito sono elencate e descritte in successione le varie fasi, che devono essere rigorosamente rispettate per l’avvio e l’esecuzione di una lista di lavoro.

5.1 Procedura di accensione (TaqMan 9600)
Accendere il PC, digitare CTRL-ALT-DEL, digitare la prima password: ALUSER (in maiuscolo), digitare la seconda password: aluser ( in minuscolo) a questo punto siamo entrati in windows.

Per entrare in ampli link: use ID (SPALL), password :(Taqman 96), invio. Accendere gli strumenti. Dalla finestra, in alto al centro, possiamo selezionare lo strumento che ci interessa: COBAS TaqMan 96.


5.2 Caricamento dei reattivi

Aprire lo sportello superiore bianco e caricare: nella posizione A il portareagenti con le biglie, indifferentemente dalla posizione B alla E caricare il portareagenti con il lysis e le sonde, indifferentemente dalla posizione F alla H il rack portacampioni, dalla posizione J alla L le SPU (le vaschette dove verrà processato il campione), ed infine alle posizioni M, N, O e P i K-tips (puntali) e i K-Tubes (provettine per l’amplificazione). Sul frontale dell’ampliprep sono situati degli indicatori dello stato funzionale dello strumento (Led). La colorazione verde indica che lo strumento è pronto per l’uso, la colorazione arancio può indicare lo stato di pausa, l’avvenuta esecuzione dei test impostati, oppure la possibilità di togliere rack vuoti , la colorazione rossa può indicare un errore oppure l’impossibilità di togliere dei rack perché sono in uso.


Dall’icona system: la digitazione di cassett/sample ci consente di controllare i reattivi caricati ed i 24 campioni. Ritornare a system e controllare i simboli reservoir 1 e 2, che indicano il livello dei tamponi, se necessario sostituirli.
5.3 Caricamento dei campioni

-Prendere un rack portacampioni, le bandierine con bare-code e provettine trasparenti (in ogni sacchetto c'è il n° necessario per 24 campioni).

- Inserire le bandierine con il bare-code, che consentono di riconoscere i campioni e i controlli, in ognuna delle 24 posizioni del rack porta-campioni e inserire le provette corrispondenti.

- Le provette di siero scongelate vanno numerate da 1 a 22, le posizioni 23 e 24 corrisponderanno ai due controlli: negativo e positivo presenti in ogni Kit di estrazione.

-Vortexare i sieri e i controlli e distribuirli nelle rispettive provette. Per l’esecuzione del test quantitativo dispensare 1100 µl.

-Controllare che nelle provette non ci siano bolle d'aria, che i tappini non siano avvitati troppo stretti e che venga rispettato il giusto avvitamento intorno alla filettatura.

Prima di inserire il rack dei campioni, eseguire la lista di lavoro selezionando l’icona order, dalla finestra che si apre selezionare sample-rack e poi new. A questo punto selezionare il test HBMCAP96, indicare sella sezione comment il n° della seduta, nella sezione batch il n° del rack usato ed infine nella sezione order/lot number identificare i campioni, cliccare su save per salvare la lista.

Se carichiamo 48 campioni, dopo la programmazione della lista di lavoro relativa ai primi 24, introdurre i successivi 24 campioni, preparare la seconda lista di lavoro, a questo punto lo strumento partirà automaticamente.

Sulla sinistra del video apparirà l'ora di fine estrazione, circa 2 ore per 24 campioni, e 3 ore per 48. Premere START per avviare l'estrazione.

Al termine dell'estrazione il led, in corrispondenza della posizione dei campioni, diventerà arancione.

I campioni/ controlli estratti posizionati sul K-karrier alla fine della estrazione vengono trasportati automaticamente in uno dei quattro

thermalcycler presenti nello strumento TaqMan96 per essere amplificati, tramite la docking station posizionata tra l’AmpliLink e il TaqMan96 i risultati si avranno in 1 ora e mezza circa. Al termine del processo, selezionare dall’icona risultati la seduta che ci interessa, dare accept e stampare i risultati. Quando ad un campione compare la scritta S_DRIFT_HIGH, va stampato il grafico della cinetica dell’amplificazione.

Dopo la stampa dei risultati si può procedere all’archiviazione delle sedute, come annotato sulla guida rapida.


5.4 Interfacciamento dello strumento per la determinazione dell’HCV RNA Quantitativo con il sistema informatico del Laboratorio WLab
Al fine di trasferire i risultati ottenuti con l’apparecchio TaqMan direttamento al Wlab, si deve procedere nella seguente maniera:

  • Aprire Wif sul computer vicino alla cappa

  • Dalla botticella” (icona) di SN ricevere ordini dall’accettazione (selezionare HCV, dal giorno/al giorno, anche esami già letti, esegui)

  • Aprire la cartellina gialla e selezionare HCV

  • Eliminare tutti i pazienti che non si desiderano trasmettere e poi cliccare applica; chiudere da X (importante: se ci sono 2 liste di lavoro nella stessa giornata selezionare tutti i 44 pazienti e poi trasmetterli tutti insieme)[ Con il cursore si evidenzia il nome del paziente, si clicca si ELIMINA e poi APPLICA]

  • Cliccare su HCV->1-DxALink (icona in basso a Dx)

  • Cliccare su T di trasmetti ordini

  • Alla fine della trasmissione andare sul computer dell’ampliprep e posizionarsi su order, sample rack, new: nel campo sample rack ID mettere il n° del sample rack che si vuole utilizzare, nel campo batch ID mettere il n° di seduta CQ e la data del giorno che si esegue, nel campo comment mettere di nuovo il n° di seduta, nel campo sample ID cliccare 2 volte con il tasto Sn del mouse; appariranno i campioni trasmessi. Di questi solo il primo è evidenziato: tenere premuto shift e ↓ ed evidenziare tutti i campioni fino al n° 22 della seduta. Cliccare ok. I campioni verranno trasferiti sul sample rack. Mettere in 23 il ctr neg cliccando 2 volte con il tasto Sn del mouse in pos 23 sul simbolo S e selezionando NC ed in 24 il ctr low pos facendo la stessa operazione e selezionando LPC. Infine salvare la lista di lavoro con save (in basso a Dx). Se si deve eseguire un’altra lista di lavoro ripete la stessa operazione a partire da sample rack, newLa mattina successiva, sul computer dell’ampliprep andare sull’icona risultati (quella con l’occhiolino), evidenziare la seduta di interesse e cliccare accept (in basso a dx)

  • Aprire WIF ed attivare l’icona in basso HCV COBAS2 e cliccare su R (Ricezione risultati)

  • Dopo la ricezione aprire la cartellina gialla, selezionare HCV2, modificare il risultato dei campioni che durante la prima giornata sono stati diluiti, quando lo strumento dà i seguenti messaggi: _Q_QS_INVALID , oppure _S_DRIFT_High, anche il valore >96.000.000 VA INSERITO MANUALENTE ), cliccare applica.

  • Cliccare sulla “botticella” di Dx (trascrivi i risultati sui referti) e cliccare esegui




  • Andare in Wlab e da risultati selezionare stampa di controllo, scegliere epatite C da biologia molecolare, mettere la data dei campioni che sono stati lavorati, stampare e numerare il piano di lavoro con il N° del campione e della seduta.


DOPO LA RICEZIONE DEI RISULTATI
-Uscire da amplilink 3.1.2: cliccare file, shut down, yes. Alla chiusura cliccare start, in basso a destra, di nuovo shut- down, yes, apparirà la scritta restart, spegnere il computer e poi l’ampliprep.

5.5 Procedura di chiusura dell’ampliprep:



-Sul monitor selezionare lo strumento AmpliPrep.

-Togliere i reattivi ed il monouso utilizzato dallo strumento, accendere gli UV per 30 minuti. L’accensione degli UV va fatta dal monitor digitando sull’icona service-all selezionare UV, digitare perform e poi next.

5.6 Manutenzione giornaliera su Ampliprep:

La manutenzione deve essere eseguita giornalmente prima di avviare la seduta e prevede la seguente procedura:

dalla icona 3 selezionare la finestra service-due per eseguire le operazioni di manutenzione giornaliera, oppure service-all per tutte le altre operazioni di manutenzione. Da service-due appare daily maintainance in blu: cliccare perform e next, l'AmpliPrep muoverà i transfer. Attendere il passed e poi next:cambiare la tanica.

Next: pulire la piattaforma (tutta la superficie nera), con un Kimberly-Clark o scottex imbevuto di alcool al 70 %,poi asciugare.

Pulire le posizioni di inizializzazione (le 2 torrette di metallo) con acqua deionizzata e poi asciugare.



Next: l'AmpliPrep muove i transfer al centro, aprire il coperchio trasparente e pulire i sensori con alcool (tutte le parti verdi in prossimità dei led rossi ed il parallelepipedo nero sul transfer di sinistra che reca una lente nella parte interna), asciugare.

Next: L'ampliprep eseguirà il prime.Aprire il cassetto bianco in basso (allo strumento) ed ispezionare tubi e siringhe e verificare che non ci siano perdite o bolle di aria.


5.7 Manutenzione periodica degli strumenti ampliprep e TaqMan:


vedi stessa sezione TaqMan 4800

5.8 Modalità esecutive delle urgenze

Il test HCV RNA che arriva in urgenza va eseguito con il COBAS TAQMAN 96 secondo le istruzioni operative sopra descritte. I campioni che si presentano visibilmente problematici (bemolizzati, lipemici, ecc) vanno centrifugati per 5 min a 12.000 rpm nella minicentrifuga prima di procedere all’ estrazione. I campioni risultati >69.000.000 IU/ml vanno refertati come tali, senza procedere ad eventuali diluizioni al fine di ottenere il numero esatto di IU/ml. Se il volume disponibile per eseguire il test risulta insufficiente, deve essere diluito fino ad arrivare al volume richiesto per l’esecuzione del test con siero negativo umano (negativo per HCV RNA) fornito dalla ditta Roche, presente come riserva nella camera fredda ( +4°C). Il test deve essere eseguito anche per confermare i casi di HCV Ab dubbi.

In caso di rottura dello strumento COBAS TAQMAN 96, il test va eseguito sullo strumento semi-automatico COBAS 48. Essendo quest’ultimo uno strumento semiautomatico è richiesto l’intervento umano per avviare i campioni ed i controlli estratti dall’Ampliprep COBAS 48 all’ amplificazione, l’operazione deve essere eseguita entro 2 ore dall’estrazione. Estrarre il rack che trasporta i K-carrier dall’ampliprep, con l l’apposito K-carrier capping tools (pinza specifica)e posizionarlo nello strumento Cobas TaqMan 48 per eseguire l’amplificazione. Di seguito è riportata la procedura in caso di urgenza con richiesta contemporanea di più test da eseguire nel Cobas 9600.

Nel caso di richiesta contemporanea di esecuzione dei test HBV-DNA, HCV-RNA, HIV-RNA ( ESEMPIO DONATORE NON CLASSIFICABILE) , si deve procedere nel seguente modo:



  1. Si deve fare l’accettazione su WLab di ciascun test (HCQT, HBQT, HIQT) e stampare la lista di lavoro

  2. Il compiuter adiacente al 9600 è routinariamente connesso con HBV2/cobas2 e HCV1/cobas 1. aprire la botticella sullo schermo e selezionare il test HBV da eseguire e trasmettere allo strumento. A questo punto bisogna fare la ricezione del test HCV, quindi si procede alla chiusura della connessione HBV2/ cobas 2 e HCV1/cobas1 e aprire la connessione HCV2/cobas2, nuovamente dalla botticella trasmettere le informazioni allo strumento.

  3. se le determinazioni da eseguire sul campione urgente sono più di una (HCVRNA , HIVRNA, HBVDNA) è necessario disporre i campioni con i relativi controlli in rack separati, tanti quante sono le determinazione da eseguire (per un massimo di tre rack per tre determinazioni)

  4. Nel caso in cui il campione risulti insufficiente per l’esecuzione di uno o più test è indispensabile diluirlo con siero negativo fornito dalla Roche. Il fattore di diluizione va annotato nel piano di lavoro e riportato nel foglio dei risultati per la correzione del valore finale. Quantità finale da inserire nello strumento per l’estrazione=1100 microlitri.

  5. Sia il COBAS96, che il COBAS48 non accettano più di due rack alla volta, per cui il 3° esame va inserito a distanza di 50 minuti.

  6. Accertarsi, prima di caricare i campioni nello strumento che siano state predisposte le biglie per l’esecuzione di tutti e tre i test ( HBV, HCV, HIV) altrimenti non si possono più aggiungere fino al termine della seduta ( ovvero quando escono i risultati), i reattivi con le biglie per i tre test vanno allocati nella posizione A dello strumento, per l’allocazione degli altri reagenti vale quanto descritto nelle procedure di settore.

  7. Ricordansi di non spegnere mai l’ampliprep fino a che è in funzione il TaqMan 9600

  8. Per il traferimento dei risultati vale quanto descritto nelle procedure di settore e i risultati vanno trasferiti richiamando il singolo esame ( non tutti insieme).

  9. L’HBV-DNA VA ESEGUITO singolarmente in caso di valori vvc o debole positività di HBsAg, o dietro espressa richiesta del Centro Trapianti

  10. L’HCV-RNA va eseguito singolarmente in caso di valori vivino al cut-off o debole positività di anti-HCV Ab o dietro espressa richiesta del Centro Trapianti, l’HIV RNA va eseguito singolarmente in caso di valori vivino al cut-off, positività del test HIV Ab, o dietro espressa richiesta del centro trapianti



  1. Per la validazione e refertazione si rimanda alle procedure di settore.



5.9 Criteri di validazione e interpretazione dei risultati

Il responsabile del settore provvederà a controllare i risultati, la verifica comprende l’avvenuta amplificazione del controllo interno, il controllo dello storico e l’avvenuta trasmissione dei risultati.


I risultati vengono trasferiti dal tecnico dopo la consultazione con il responsabile del settore, il range dinamico è compreso tra 43 UI/ml e 69.000.000 UI/ml.

  • Se il risultato positivo ma inferiore a 15 UI/ml, il risultato da refertare è Positivo <15 IU/ml (i campioni con risultato _S_ Below_ range),

  • Se il risultato del test è compreso tra 15 e 43 UI/ml il risultato da refertare è Rilevato< 43 UI/ml.

  • Il risultato è “Target not detected “ va refertato come Negativo ( inferiore al limite di sensibilità)

  • Nel caso dell’esecuzione del test con il campione diluito, il dirigente deve inserire una nota dove indica la variazione del limite di sensibilità in relazione al fattore di diluizione adottato

La ripetizione di un test deve essere eseguita



  • se il test è venuto invalid (controllo interno non è stato amplificato o se è stato amplificato poco)

  • in presenza di una viremia HCV positiva in assenza di anticorpi anti-HCV

  • se il risultato è Positivo< 15 UI/ml o Rilevato< 43 UI/ml, in assenza di storico.

Laboratorio di Virologia

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