Regolamento (cee) n



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REGOLAMENTO (CEE) n. 2568/91 DELLA COMMISSIONE dell'11 luglio 1991 relativo alle caratteristiche degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva nonché ai metodi ad essi attinenti

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,

visto il regolamento n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre 1966, relativo all'attuazione di

un'organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi (1), modificato da ultimo dal

regolamento (CEE) n. 3577/90 (2), in particolare l'articolo 35 bis,

considerando che l'allegato del regolamento n. 136/66/CEE

prevede le denominazioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansa d'oliva commercializzati

nei singoli Stati membri, nonché negli scambi intracomunitari e con i paesi terzi;

considerando che per poter distinguere i vari tipi di olio è opportuno definire le caratteristiche

fisico-chimiche di ciascuno di essi, nonché le caratteristiche organolettiche degli oli vergini, per

garantire la purezza e la qualità dei prodotti in parola, salve le altre disposizioni vigenti in materia;

considerando che è opportuno stabilire in modo uniforme in tutta la Comunità la presenza delle

caratteristiche dei vari tipi di olio; che a tal fine occorre stabilire i metodi comunitari di analisi

chimica e di valutazione organolettica; che occorre tuttavia autorizzare, durante un periodo

transitorio, il ricorso ad altri metodi di analisi applicati negli Stati membri pur prevedendo che, in

caso di divergenza dei risultati, saranno determinanti quelli ottenuti in base al metodo comune;

considerando che la definizione delle caratteristiche fisicochimiche degli oli d'oliva e dei metodi di

analisi comporta l'adattamento delle note complementari del capitolo 15 della nomenclatura

combinata;

considerando che il metodo di valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli vergini

implica la costituzione di comitati di assaggiatori selezionati ed esperti e che è pertanto

opportuno prevedere il termine necessario per la realizzazione di siffatta struttura; che, tenuto

conto delle difficoltà che taluni Stati membri dovranno affrontare per la costituzione dei comitati di

assaggio, è opportuno autorizzare il ricorso ai comitati esistenti negli altri Stati membri;

considerando che per garantire il corretto funzionamento del sistema dei prelievi applicabili

all'importazione di sanse di oliva, è opportuno prescrivere un metodo unico per determinare il

tenore in olio di questi prodotti;

considerando che per non recare pregiudizio agli scambi è opportuno prevedere un periodo

limitato per lo smaltimento dell'olio condizionato prima dell'entrata in vigore del presente

regolamento;

considerando che è opportuno abrogare il regolamento (CEE) n. 1058/77 della Commissione (3),

modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 1858/88 (4);

considerando che il comitato di gestione per i grani non ha emesso alcun parere nel termine fissato

dal suo presidente,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:


Articolo 1

1. Sono considerati oli d'oliva vergini ai sensi del punto 1, lettere a), b) e c) dell'allegato del

regolamento n. 136/66/CEE gli oli le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate

rispettivamente nei punti 1, 2 e 3 dell'allegato I del presente regolamento.

2. È considerato olio d'oliva vergine lampante ai sensi del punto 1, lettera d) dell'allegato del

regolamento n. 136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato

I, punto 4, del presente regolamento.

3. È considerato olio d'oliva raffinato ai sensi del punto 2 dell'allegato del regolamento n.

136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 5, del

presente regolamento.

4. È considerato olio d'oliva ai sensi del punto 3 dell'allegato del regolamento n. 136/66/CEE,

l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 6, del presente

regolamento.

5. È considerato olio di sansa d'oliva greggio ai sensi del punto 4 dell'allegato del regolamento n.

136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 7, del

presente regolamento.

6. È considerato olio di sansa d'oliva raffinato ai sensi del punto 5 dell'allegato del regolamento n.

136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 8, del

presente regolamento.

7. E considerato olio di sansa d'oliva ai sensi del punto 6 dell'allegato del regolamento n.

136/66/CEE, l'olio le cui caratteristiche sono conformi a quelle indicate nell'allegato I, punto 9, del

presente regolamento.


Articolo 2

1. Le caratteristiche degli oli contemplati nell'allegato I sono determinate in base ai seguenti metodi

di analisi:

- per la determinazione degli acidi grassi liberi, espressi in percentuale di acido oleico, il metodo di

cui all'allegato II,

- per la determinazione dell'indice di perossido, il metodo di cui all'allegato III,

- per la determinazione degli alcoli alifatici, il metodo di cui all'allegato IV,

- per la determinazione del contenuto di steroli, il metodo di cui all'allegato V,

- per la determinazione dell'eritrodiolo + uvaolo, il metodo di cui all'allegato VI,

- per la determinazione degli acidi grassi saturi in posizione 2 del trigliceride, il metodo di cui

all'allegato VII,

- per la determinazione del tenore di trigliceridi, il metodo di cui all'allegato VIII,

- per l'analisi spettrofotometrica, il metodo di cui

all'allegato IX,

- per la determinazione della composizione di acidi grassi, il metodo di cui all'allegato X «A» e X

«B»,


- per la determinazione dei solventi alogenati volatili, il metodo di cui all'allegato XI,

- per la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli oli d'oliva vergini, il metodo di cui

all'allegato XII, applicato conformemente al paragrafo 2,

- per la prova di raffinazione, il metodo di cui all'allegato XIII.

2. L'analista, anche assistito da periti, procede alla valutazione delle caratteristiche organolettiche

secondo la procedura descritta nella scheda di assaggio di cui all'allegato XII. Qualora l'analista

constati caratteristiche organolettiche diverse da quelle risultanti dalla denominazione del prodotto,

è tenuto a fare esaminare il campione da un comitato di assaggio, conformemente alle disposizioni

dell'allegato XII.

Ogni analisi di revisione è effettuata dal comitato di assaggio conformemente alle dette disposizioni.


Per la valutazione delle caratteristiche organolettiche nel corso delle operazioni legate al regime

d'intervento il comitato di assaggio procede a tale valutazione conformemente all'allegato XII.


Articolo 3

Fino al 31 ottobre 1992, l'introduzione dei metodi di analisi contemplati all'articolo 2 non osta a

che gli Stati membri adottino altri metodi provati e scientificamente affidabili, a condizione di non

ostacolare la libera circolazione dei prodotti riconosciuti conformi alla normativa di applicazione

dei metodi comunitari. Gli Stati membri interessati notificano tali altri metodi alla Commissione

prima di applicarli.

Qualora uno di questi altri metodi dovesse dare un risultato diverso da quello ottenuto con

l'applicazione del metodo comune, si tiene conto solo del risultato ottenuto con l'applicazione del

metodo comune.
Articolo 4

1. Ai fini della valutazione delle caratteristiche organolettiche, gli Stati membri istituiscono comitati

assaggiatori selezionati ed addestrati secondo le norme previste nel metodo descritto all'allegato

XII.


2. Qualora uno Stato membro dovesse incontrare difficoltà per istituire un comitato di assaggio sul

proprio territorio, potrà fare ricorso ad un comitato operante in altro Stato membro.


Articolo 5

Le note complementari n. 2, 3 e 4 del capitolo 15 della nomenclatura combinata sono sostituite da

quelle che figurano nell'allegato XIV del presente regolamento.
Articolo 6

1. Il tenore in olio delle sanse e degli altri residui dell'estrazione dell'olio (codice NC 2306 90 11 e

2306 90 19) è determinato conformemente al metodo che figura nell'allegato XV.

2. Il tenore in olio di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del suo peso rispetto a quello

della sostanza secca.
Articolo 7

Si applicano le disposizioni comunitarie relative alla presenza di sostanze indesiderabili diverse da

quelle di cui all'allegato XI.
Articolo 8

1. Ogni Stato membro comunica alla Commissione le misure adottate per l'applicazione del

presente regolamento.

2. Ogni Stato membro comunica alla Commissione, alla fine di ogni semestre, un riassunto dei dati

analitici delle determinazioni effettuati nel corso del semestre precedente.

Detti risultati sono esaminati dal comitato di gestione dei grassi secondo la procedura prevista

all'articolo 39 del regolamento n. 136/66/CEE.
Articolo 9

Il regolamento (CEE) n. 1058/77 è abrogato.


Articolo 10

1. Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo a quello della pubblicazione

nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Tuttavia, il metodo che figura nell'allegato XII viene applicato a decorrere dal 1o gennaio 1992,

salvo per quanto riguarda le operazioni legate all'intervento.

2. Il presente regolamento non si applica agli oli d'oliva e agli oli di sansa d'oliva condizionati

anteriormente all'entrata in vigore del presente regolamento e commercializzati fino al 31 ottobre

1992.


Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno

degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, l'11 luglio 1991.

Per la Commissione

RAY MAC SHARRY

Membro della Commissione


(1) GU n. 172 del 30. 9. 1966, pag. 3025/66.(2) GU n. L 353 del 17. 12. 1990, pag. 23.(3) GU

n. L 128 del 24. 5. 1977, pag. 6.(4) GU n. L 166 dell'1. 7. 1988, pag. 10.


ALLEGATI

Sommario Pagina

Allegato I:

Caratteristiche degli oli di oliva .

4

Allegato II:



Determinazione dell'acidità .

6

Allegato III:



Determinazione del numero di perossidi .

8

Allegato IV:



Determinazione del contenuto di alcoli alifatici mediante gascromatografia con colonna capillare .

10

Allegato V:



Determinazione della composizione e del contenuto di steroli mediante gascromatografia con

colonna capillare .

15

Allegato VI:



Determinazione dell'eritrodiolo e dell'uvaolo .

23

Allegato VII:



Determinazione degli acidi grassi in posizione 2 nel trigliceride .

25

Allegato VIII:



Determinazione del contenuto di trilinoleina .

29

Allegato IX:



Analisi spettrofotometrica nell'ultravioletto .

33

Allegato X «A»:



Analisi gascromatografica degli esteri metilici degli acidi grassi .

36

Allegato X «B»:



Preparazione degli esteri metilici di acidi grassi in conformità all'allegato VI - punti I e II del

regolamento (CEE) n. 72/77 della Commissione oppure in alternativa il metodo seguente .

44

Allegato XI:



Determinazione del tenore dei solventi alogenati .

48

Allegato XII:



Valutazione organolettica dell'olio di oliva vergine .

49

Allegato XIII:



Prova della raffinazione .

75

Allegato XIV:



Note complementari 2, 3 e 4 del capitolo 15 della Nomenclatura combinata .

77

Allegato XV:



Metodo di determinazione del tenore in olio d'oliva delle sanse .

80

Allegato XVI:



Determinazione del numero di iodio .

82
ALLEGATO I

CARATTERISTICHE DEGLI OLI D'OLIVA
Categoria

Acidità


%

Numero dei

perossidi

mcq/O2/kg

Solventi

alogenati

mg/kg (¹)

Alcoli


olifatici

mg/kg


Acidi saturi

in

posizione 2



del

trigliceride

%

Eritrodiolo



+ uvaolo

%

Trilinoleina



%

Colesterolo

%

Brossicasterolo



%

Campesterolo

%

Stigmesterolo



%

Beta


sitosterolo

% (²)


Delta 7

stigmesterolo

%

Steroidi


totali

mg/kg


1. Olio di oliva vergine

extra


M 1,0

M 20


M 0,20

M 300


M 1,3

M 4,5


M 0,5

M 0,5


M 0,2

M 4,0


< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 000


2. Olio di oliva vergine

M 2,0


M 20

M 0,20


M 300

M 1,3


M 4,5

M 0,5


M 0,5

M 0,2


M 4,0

< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 000


3. Olio di oliva vergine

corrente


M 3,3

M 20


M 0,20

M 300


M 1,3

M 4,5


M 0,5

M 0,5


M 0,2

M 4,0


< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 000


4. Olio di oliva vergine

lampante


> 3,3

> 20


> 0,20

M 400


M 1,3

M 4,5


M 0,5

M 0,5


M 0,2

M 4,0


-

m 93,0


M 0,5

m 1 000


5. Olio di oliva

raffinato

M 0,5

M 10


M 0,20

M 350


M 1,5

M 4,5


M 0,5

M 0,5


M 0,2

M 4,0


< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 000


6. Olio di oliva

M 1,5


M 15

M 0,20


M 350

M 1,5


M 4,5

M 0,5


M 0,5

M 0,2


M 4,0

< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 000


7. Olio di sansa di

oliva greggio

m 2,0

-

-



-

M 1,8


m 12

M 0,5


M 0,5

M 0,2


M 4,0

-

m 93,0



M 0,5

m 2 500


8. Olio di sansa di

oliva raffinato

M 0,5

M 10


M 0,20

-

M 2,0



m 12

M 0,5


M 0,5

M 0,2


M 4,0

< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 800


9. Olio di sansa d'oliva

M 1,5


M 15

M 0,20


-

M 2,0


> 4,5

M 0,5


M 0,5

M 0,2


M 4,0

< Camp.

m 93,0


M 0,5

m 1 800


M = massimo, m = minimo.

Nota:


Per classificare diversamente un olio o dichiararlo non conforme per la purezza è sufficiente che

uno solo dei requisiti non rientri nei limiti fissati.

(¹) Limite massimo complessivo per i composti rivelati dal rivelatore a cattura di elettroni. Per i

componenti accertati singolarmente il limite massimo è 0,10 mg/kg.

(²) (Delta-5-23-Stigmastadiemolo+

Clerosterolo+Betasitosterolo+Sitostanolo+Delta-5-Avenasterolo+Delta-5-24 Stigmastadienolo).


ALLEGATO I (seguito)

Categoria

Composizione acidica

Niriatico

%

Linolenico



%

Arachido


%

Eicoeenico

%

Beenico


%

Lignocerico

%

K232


K270

K270 con


allumina (¹)

Delta K


Panel test

1. Olio di oliva

vergine extra

M 0,1


M 0,9

M 0,7


M 0,5

M 0,3


M 0,5

M 2,40


M 0,20

M 0,10


M 0,01

86,5


2. Olio di oliva

vergine


M 0,1

M 0,9


M 0,7

M 0,5


M 0,3

M 0,5


M 2,60

M 0,25


M 0,10

M 0,01


85,5

3. Olio di oliva

vergine corrente

M 0,1


M 0,9

M 0,7


M 0,5

M 0,3


M 0,5

M 2,60


M 0,25

M 0,10


M 0,01

83,5


4. Olio di oliva

vergine lampante

M 0,1

M 0,9


M 0,7

M 0,5


M 0,3

M 0,5
> 0,25

M 0,11

-

< 3,5



5. Olio di oliva

raffinato

M 0,1

M 0,9


M 0,7

M 0,5


M 0,3

M 0,5


M 3,40

M 1,20


-

M 0,16


-

6. Olio di oliva

M 0,1

M 0,9


M 0,7

M 0,5


M 0,3

M 0,5


M 3,40

M 1,00


-

M 0,13


-

7. Olio di sansa

di oliva greggio

M 0,1


M 0,9

M 0,7


M 0,5

M 0,3


M 0,5

-

-



-

-

-



8. Olio di sansa

di oliva raffinato

M 0,1

M 0,9


M 0,7

M 0,5


M 0,3

M 0,5


M 5,50

M 2,50


-

M 0,25


-

9. Olio di sansa

d'oliva

M 0,1


M 0,9

M 0,7


M 0,5

M 0,3


M 0,5

M 5,50


M 2,00

-

M 0,20



-

Nota:


Ai fini della constatazione della purezza, qualora il K270 superi il limite della categoria

corrispondente, si deve procedere alla determinazione del K270 dopo il passaggio su allumina.

(¹) Nel caso di oli con acidità superiore al 3,3 % se dopo il passaggio su allumina si ottiene K270

superiore a 0,11 si deve effettuare la prova di raffinazione prevista dall'allegato XIII.

ALLEGATO II

DETERMINAZIONE DELL'ACIDITÀ 1.

OGGETTO

Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi grassi liberi viene espresso

mediante l'acidità calcolata in modo convenzionale.

1.1.


Principio

Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela di solventi, poi titolazione

degli acidi grassi liberi presenti mediante una soluzione etanolica di idrossido di potassio.

1.2.


Reattivi

Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua impiegata dev'essere acqua

distillata o di purezza equivalente.

1.2.1.


Etere dietilico - etanolo al 95 % (V/V), miscela 1 - 1 in volume.

Nota: l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplosivi. Esso deve pertanto

essere usato con precauzioni particolari.

Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di idrossido di potassio (1.2.2)

in presenza di 0,3 ml della soluzione di fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela.

Nota: se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una miscela di solventi costituita da

etanolo e da toluene. Se necessario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.

1.2.2.


Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata c(KOH) all'incirca 0,1 mol oppure, se

necessario, c(COH) 0,5 mol circa.

La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio deve essere nota e

verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare una soluzione preparata almeno 5 giorni prima

dell'uso e decantata in un flacone di vetro bruno chiuso con un tappo di gomma. La soluzione deve

essere incolore o giallo pallida.

Nota: una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere preparata come segue.

Portare e mantenere per un'ora all'ebollizione a ricadere 1 000 ml di etanolo con 8 g di idrossido

di potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente. Sciogliere nel distillato il

quantitativo necessario di idrossido di potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il

liquido chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio.

La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come segue. A 1 000 ml di etanolo

aggiungere 4 ml di butilato di alluminio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare

il liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Questa

soluzione è pronta per l'uso.

1.2.3.


Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alcalino (nel caso di sostanze

grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l nell'etanolo al 95-96 % (V/V).

1.3.

Apparecchiatura



Materiale corrente da laboratorio, in particolare:

1.3.1.


Bilancia analitica.

1.3.2.


Beuta, avente una capacità di 250 ml.

1.3.3.


Buretta, avente una capacità di 10 ml, graduata in 0,05 ml.

1.4.


Modo di operare

1.4.1.


Preparazione del campione da analizzare.

La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità + impurezze è inferiore

all'1 %, sul campione tal quale.

1.4.2.


Sostanza da analizzare

Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero di acidità presunto,

secondo le indicazioni della seguente tabella.

Numero di acidità

presunto

Massa della sostanza

da analizzare

(in g)


Precisione della pesata della

sostanza da analizzare

(in g)

< 1

1 a 4


4 a 15

15 a 75


> 75

20,


10,

2,5


0,5

0,1


0,05

0,02


0,01

0,001


0,0002
Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).

1.4.3.


Determinazione

Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50-150 ml della miscela etere

etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata.

Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l (1.2.2) (vedi nota z) fino a

viraggio dell'indicatore (colorazione rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s).

Nota 1: La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può essere sostituita con una

soluzione acquosa di idrossido di potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non

comporta una separazione di fasi.

Nota 2: Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l supera i 10

ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l.

Nota 3: Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere un quantitativo sufficiente

della miscela di solventi (1.2.1) per ottenere una soluzione chiara.

1.5.

Espressione dell'acidità come % di acido oleico.



L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:

V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

V × c ×

M

1 000



×

100


m

=

V × c × M



10 × m

dove:


V = è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

c

=



è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata;

M

=



è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per l'espressione del risultato

(acido oleico = 282);

m

=

è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare.



Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni.

ALLEGATO III

DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI PEROSSIDI 1.

OGGETTO


Si tratta di un metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli e grassi.

2.


CAMPO D'APPLICAZIONE

Oli e grassi animali e vegetali.

3.

DEFINIZIONE



Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel campione, espresse in

milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossidano lo ioduro di potassio nelle condizioni che

vengono descritte.

4.


PRINCIPIO

Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio, con una soluzione di

ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con soluzione di tiosolfato di sodio

standardizzata.

5.

APPARECCHIATURA



Tutta l'apparecchiatura usata dev'essere esente da sostanze riducenti od ossidanti.

Nota: Non ungere le superfici smerigliate.

5.1.

Ditale di vetro da 3 ml.



5.2.

Palloni a collo e (tappo smerigliato), aventi una capacità di circa 250 ml, previamente asciugati e

riempiti di gas puro, secco inerte (azoto o, di preferenza, anidride carbonica).

5.3.


Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml.

6.


REAGENTI

6.1.


Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una

corrente di gas inerte puro e secco.

6.2.

Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una



corrente di gas puro e secco.

6.3.


Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati.

6.4.


Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente standardizzata

immediatamente prima dell'uso.

6.5.

Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione da amido naturale



solubile.

7.


CAMPIONE

Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco e mettendolo in

contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati ermeticamente con tappi a smeriglio o di

sughero.

8.

PROCEDIMENTO



La prova dev'essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce artificiale. Pesare in un

ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g,

una massa del campione conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:

Numero di perossidi previsto

(meq)

Peso della sostanza da analizzare



(in g)

0 - 12


12 - 20

20 - 30


30 - 50

50 - 90


5,0 - 2,0

2,0 - 1,2

1,2 - 0,8

0,8 - 0,5

0,5 - 0,3
Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare.

Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando.

Aggiungere 15 ml di acido acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3).

Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al riparo dalla

luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25 oC.

Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato

di sodio (6.4) (soluzione 0,002 N per valori previsti inferiori a 12 e soluzione 0,01 N per valori

previsti superiori a 12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come

indicatore.

Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.

Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del bianco supera 0,05 ml di

soluzione 0,01 N di tiosolfato di sodio (6.4), sostituire i reagenti impuri.

9.

ESPRESSIONE DEI RISULTATI



Il numero di perossidi (P.V.), espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, viene dato dalla

formula:

P.V. = V × T × 1 000

P.V. =


V × T

m

× 1 000



dove:

V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio (6.4) usata per la prova,

corretto in modo da tener conto della prova in bianco.

T

=



è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) usata.

m

=



è il peso in g della sostanza da analizzare.

Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni eseguite.

ALLEGATO IV

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI ALCOLI ALIFATICI MEDIANTE

GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE 1.

OGGETTO


Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di alcoli alifatici, singoli e

totali, delle sostanze grasse.

2.

PRINCIPIO DEL METODO



La sostanza grassa, addizionata di 1-eicosanolo quale standard interno, è saponificata con

idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione degli alcoli mediante cromatografia su placca di

gel di silice basica; gli alcoli recuperati dal gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed

analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a smeriglio.

3.2.


Imbuti separatori da 500 ml.

3.3.


Matracci da 250 ml.

3.4.


Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre di vetro 20 × 20 cm.

3.5.


Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.

3.6.


Microsiringhe da 100 ml e 500 ml.

3.7.


Imbuto filtrante cilindrico con setto poroso G 3 (porosità 15-40 ml) di diametro circa 2 cm e

altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtrazione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio

12/21.

3.8.


Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adattabile all'imbuto filtrante (3.7).
3.9.

Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.

3.10.

Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di



splittaggio, costituito da:

3.10.1.


Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura desiderata con la

precisione di p1 oC.

3.10.2.

Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporizzante in vetro persilanizzato.

3.10.3.

Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.

3.10.4.

Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.10.3), con

tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.11.


Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro interno 0,25 + 0,32 mm,

internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso

fra 0,10 e 0,30 mm.

3.12.


Microsiringa per gascromatografia da 10 ml con ago cementato.

4.


REAGENTI

4.1.


Potassio idrossido, soluzione metanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di

idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro

con etanolo. La soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.

4.2.


Etere etilico, puro per analisi.

4.3.


Sodio solfato anidro, puro per analisi.

4.4.


Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm

(sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).

4.5.

Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio in 20



ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo.

4.6.


Benzene, per cromatografia. (vedi 5.2.2)

4.7.


Acetone, per cromatografia. (vedi 5.2.2)

4.8.


Esano, per cromatografia. (vedi 5.2.2)

4.9.


Etere etilico, per cromatografia.

4.10.


Cloroformio, puro per analisi.

4.11.


Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: miscela di alcoli da C20 a C28 soluzione

al 5 % in cloroformio.

4.12.

2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende leggermente basica aggiungendo



qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di idrossido di potassio.

4.13.


Piridina anidra, per cromatografia.

4.14.


Esametildisilazano.

4.15.


Trimetilclorosilano.

4.16.


Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli alcoli alifatici da C20 a C28. Si preparano al momento

dell'impiego da miscele di alcoli puri.

4.17.

1-eicosanolo, soluzione allo 0,1 (m/V) in cloroformio (standard interno).



4.18.

Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.

4.19.

Gas ausiliari:



- idrogeno, puro per gascromatografia

- aria, pura per gascromatografia.

5.

PROCEDIMENTO



5.1.

Preparazione dell'insaponificabile.

5.1.1.

Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegando la microsiringa da 500 ml, un volume di

soluzione di 1-eicosanolo (; ) allo 0,1 % in cloroformio (4.17) che contenga una quantità di

1-eicosanolo corrispondente a circa il 10 % del contenuto di alcoli alifatici nell'aliquota di

campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di campione si aggiungano 250

ml della soluzione di 1-eicosanolo allo 0,1 % se trattasi di oli di oliva o di semi e 1 500 ml se

trattasi di olio di sansa di oliva.

Si evapora il cloroformio in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso matraccio si

pesano esattamente circa 5 g di campione secco e filtrato.

5.1.2.


Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N, si applica il refrigerante a

ricadere e si scalda a leggera ebollizione su bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a

saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20

minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si

stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30 oC.

5.1.3.


Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml,

aiutandosi con acqua distillata, a più riprese, impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si

aggiungono circa 80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si lascia

stratificare (nota 1).

Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo imbuto separatore. Sulla fase

acquosa si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70

ml di etere etilico.

Nota 1 - Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo, mediante spruzzetta, piccole

quantità di alcool etilico o metilico.

5.1.4.


Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano con acqua distillata (50 ml

per volta) fino a reazione neutra delle acque di lavaggio.

Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si filtra, su solfato sodico

anidro, in un matraccio da 250 ml previamente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità

di etere etilico.

(; ) Può essere usato in alternativa 1-eneicosanolo.

5.1.5.

Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero vuoto o in corrente di azoto,

si completa l'essiccamento in stufa a 100 oC per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in

essiccatore, si pesa.

5.2.

Separazione della frazione degli alcoli.



5.2.1.

Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice (4.4.), completamente, nella

soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi

asciugare sotto cappa per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100 oC per 1 ora.

Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio fino al momento

dell'impiego (le placche così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni).

Nota 2 - Impiegando per la separazione della frazione alcolica delle lastre di gel di silice basiche si

elimina la necessità del trattamento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono

trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura acida (acidi grassi ed altro)

ottenendosi così le bande degli alcoli alifatici e terpenici nettamente separate dalla banda degli

steroli.

5.2.2.


Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-acetone 95:5 (V/V) fino

all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35

(V/V). Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora in modo

che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere

fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di

ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei

componenti.

Nota 3 - Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili la miscela di sviluppo

deve essere sostituita ad ogni prova.

5.2.3.


Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in cloroformio e, con la

microsiringa da 100 ml si depositano su una placca cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una

estremità, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento

con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-3 ml della soluzione di

riferimento degli alcoli (4.11), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli alcoli

alifatici.

5.2.4.

Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in 5.2.2. La temperatura dovrà

essere mantenuta fra 15 e 20 oC. Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a

che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove

quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda oppure

lasciando la placca per un pò di tempo sotto cappa.

5.2.5.

Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina.

Osservando la lastra alla luce ultravioletta si individua la banda degli alcoli alifatici per allineamento

con la macchia ottenuta con la soluzione di riferimento e si delimita con una matita nera l'insieme

della banda degli alcoli alifatici e della banda immediatamente superiore corrispondente agli alcoli

triterpenici.

Nota 4 - La prescrizione di raccogliere insieme alla banda degli alcoli alifatici anche la banda degli

alcoli triterpenici è dettata dal fatto che in questa, nelle condizioni del metodo, vengono inglobate

significative quantità di alcoli alifatici.

5.2.6.


Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale

asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di

cloroformio caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra aiutandosi con il

vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) collegata all'imbuto filtrante.

Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml per volta) raccogliendo

sempre il filtrato nella stessa beuta adattata all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di

circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previamente pesata,

si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche

goccia di acetone, si riporta ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 oC, indi si lascia

raffreddare in essiccatore e si pesa.

Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione alcolica.

5.3.


Preparazione dei trimetilsilileteri.

5.3.1.


Nella provetta contenente la frazione alcolica si aggiunge il reattivo per la sililazione, costituito da

una miscela di piridina-esametildisilazanotrimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 5) in ragione di 50

ml per ogni milligrammo di alcoli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 6).

Nota 5 - Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti

silanizzanti, quali as esempio il bis- trimetiltrifluoroacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire

con uno stesso volume di piridina anidra.

5.3.2.

Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione degli

alcoli. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni

minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.

Nota 6 - L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcun

disturbo. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio

della presenza di umidità o di alterazione del reattivo. In questo caso la prova dovrà essere

ripetuta.

5.4.

Analisi gascromatografica.



5.4.1.

Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.

5.4.1.1.

Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso all'evaporatore

connesso col sistema di splittaggio, e il terminale di uscita al rivelatore.

Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas,

efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.).

5.4.1.2.

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento.

Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso

gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di

almeno 20 oC superiore a quella di esercizio (nota 7). Si mantiene tale temperatura per almeno 2

ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e

dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico, regolazione

della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il

segnale ad una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il

tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve

presentare deriva.

Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva

positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

Nota 7 - La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 oC

alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato.

5.4.2.

Scelta delle condizioni operative.

5.4.2.1.

Condizioni operative di massima sono le seguenti:

- temperatura della colonna: inizio isoterma 8m a 180 oC, quindi programma 5 oC/minuto fino a

260 oC e ancora 15m a 260 oC

- temperatura dell'evaporatore: 280 oC

- temperatura del rivelatore: 290 oC

- velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno 30 + 50 cm/s

- rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100

- sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima

- sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV fondo scala

- velocità della carta: 30 + 60 cm/ora

- quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 ml di soluzione di TMSE.

Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del

gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:

- il tempo di ritenzione dell'alcool C26 deve essere 18 p5 minuti

- il picco dell'alcool C22 deve essere per l'olio di oliva 80 p20 % del fondo scala e per gli oli di

semi 40 p20 % del fondo scala.

5.4.2.2.

Per verificare i suddetti requisiti si effettuano ripetute iniezioni con le miscele campione di TMSE

degli alcoli e si ritoccano le condizioni operative fino a raggiungere i migliori risultati.

5.4.2.3.

I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in modo da ottenere una corretta

valutazione delle aree dei picchi che vengono presi in considerazione.

5.4.3.


Esecuzione dell'analisi.

5.4.3.1.

Con la microsiringa da 10 ml si preleva 1 ml di esano, si aspirano 0,5 ml di aria e successivamente

0,5 + 1 ml della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago

sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e dopo 1-2

secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi.

5.4.3.2.

Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli alcoli presenti.

La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.4.1.2.).

5.4.4.


Identificazione dei picchi.

L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con

miscele di TMSE degli alcoli, analizzate nelle medesime condizioni.

Nella figura 1 è riportato un cromatogramma della frazione alcolica di un olio di oliva vergine.

5.4.5.

Valutazione quantitativa

5.4.5.1.

Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'1-eicosanolo e degli alcoli alifatici

da C22 a C28.

5.4.5.2.

Si calcola il contenuto di ogni singolo alcool, in mg/100 g di sostanza grassa come segue:

alcool x = Ax . ms . 100

alcool x =

Ax . ms . 100

As . m
in cui:

Ax = area del picco dell'alcool x, in millimetri quadrati;

As

=

area del picco dell'1-eicosanolo, in millimetri quadrati;



ms

=

peso di 1-eicosanolo aggiunto, in milligrammi;



m

=

peso del campione prelevato per la determinazione, in grammi.



6.

ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Si riportano i contenuti dei singoli alcoli alifatici, in mg/100 g di sostanza grassa e, come «alcoli

alifatici totali», la loro somma.

APPENDICE Determinazione della velocità lineare del gas

Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1 - 3 ìl di metano (o

propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento

dell'iniezione al momento dell'uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è

il tempo cronometrato in secondi.


ALLEGATO V

DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE E DEL CONTENUTO DI STEROLI

MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE 1.

OGGETTO


Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di steroli, singoli e totali,

delle sostanze grasse.

2.

PRINCIPIO DEL METODO



La sostanza grassa, addizionata di a-colestanolo quale standard interno, è saponificata con

idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione sterolica mediante cromatografia su placca di

gel di silice basica; gli steroli recuperati dal gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed

analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti a smeriglio.

3.2.


Imbuti separatori da 500 ml.

3.3.


Matracci da 250 ml.

3.4.


Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre di vetro 20 × 20 cm.

3.5.


Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.

3.6.


Microsiringhe da 100 ml e 500 ml.

3.7.


Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 mm) di diametro circa 2 cm e

altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtrazione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio

12/21.

3.8.


Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adattabile all'imbuto filtrante

(3.7.).


3.9.

Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta.

3.10.

Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di



splittaggio, costituito da:

3.10.1.


Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura desiderata con la

precisione di p1 oC.

3.10.2.

Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporizzante in vetro persilanizzato.

3.10.3.

Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore.

3.10.4.

Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.10.3.),

con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile.

3.11.


Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20 + 30 m, diametro interno 0,25 + 0,32 mm,

internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso

fra 0,10 e 0,30 mm.

3.12.


Microsiringa per gascromatografia da 10 ml con ago cementato.

4.


REAGENTI

4.1.


Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di

idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro

con etanolo. La soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate.

4.2.


Etere etilico, puro per analisi.

4.3.


Sodio solfato anidro, puro per analisi.

4.4.


Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm

(sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).

4.5.

Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio in 20 ml di



acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo.

4.6.


Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.7.


Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.8.


Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2).

4.9.


Etere etilico, per cromatografia.

4.10.


Cloroformio, puro per analisi.

4.11.


Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o fitosteroli, soluzione al 5 % in

cloroformio.

4.12.

2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende leggermente basica aggiungendo



qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di idrossido di potassio.

4.13.


Piridina anidra, per cromatografia.

4.14.


Esametildisilazano.

4.15.


Trimetilclorosilano.

4.16.


Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento dell'impiego partendo

da steroli puri o da miscele di steroli ottenute da oli che li contengano.

4.17.

a-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard interno).



4.18.

Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.

4.19.

Gas ausiliari:



- idrogeno, puro per gascromatografia

- aria, pura per gascromatografia.

5.

PROCEDIMENTO



5.1.

Preparazione dell'insaponificabile.

5.1.1.

Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da 500 ml, un volume di soluzione

di a-colestanolo allo 0,2 % in cloroformio (4.17.) che contenga una quantità di a-colestanolo

corrispondente a circa il 10 % del contenuto di steroli nell'aliquota di campione da prelevare per la

determinazione. Ad esempio per 5 g di campione si aggiungano 500 ml della soluzione di

a-colestanolo allo 0,2 % se trattasi di un olio di oliva e 1 500 ml se trattasi di oli di semi o olio di

sansa di oliva.

Si evapora in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso matraccio si pesano

esattamente 5 g di campione secco e filtrato.

In caso di oli e grassi animali o vegetali contenenti quantità notevoli di colesterolo può essere

presente un picco avente tempo di ritenzione identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare

la frazione sterolica in doppio con e senza standard interno.

5.1.2.

Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N, si applica il refrigerante a

ricadere e si scalda a leggera ebollizione su bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a

saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20

minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si

stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30 oC.

5.1.3.

Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml,

aiutandosi con acqua distillata, a più riprese, impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si

aggiungono circa 80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si lascia

stratificare (nota 1).

Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo imbuto separatore. Sulla fase

acquosa si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70

ml di etere etilico.

Nota 1 - Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo, mediante spruzzetta, piccole

quantità di alcool etilico o metilico.

5.1.4.

Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano con acqua distillata (50 ml

per volta) fino a reazione neutra delle acque di lavaggio.

Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si filtra, su solfato sodico

anidro, in un matraccio da 250 ml previamente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità

di etere etilico.

5.1.5.

Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero vuoto o in corrente di azoto,

si completa l'essiccamento in stufa a 100 oC per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in

essiccatore, si pesa.

5.2.

Separazione della frazione sterolica.



5.2.1.

Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice (4.4.), completamente, nella

soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi

asciugare sotto cappa per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100 oC per 1 ora.

Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio fino al momento

dell'impiego (le placche così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni).

Nota 2 Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle lastre di gel di silice basiche si

elimina la necessità del trattamento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono

trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura acida (acidi grassi ed altro)

ottenendosi così la banda degli steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e

triterpenici.

5.2.2.


Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-acetone 95:5 (V/V) fino

all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35

(V/V). Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora in modo

che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere

fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di

ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei

componenti.

Nota 3: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili la miscela di sviluppo

deve essere sostituita ad ogni prova.

5.2.3.


Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in cloroformio e, con la

microsiringa da 100 ml si depositano su una placca cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una

estremità, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento

con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-3 ml della soluzione di

riferimento degli steroli (4.11.), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli.
5.2.4.

Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in 5.2.2. La temperatura

ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 oC. Si chiude subito la camera col coperchio e si

lascia eluire fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della

placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di

aria calda oppure lasciando la placca per un pò di tempo sotto cappa.

5.2.5.

Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina.

Osservando la lastra alla luce ultravioletta si individua la banda degli steroli per allineamento con la

macchia ottenuta con la soluzione di riferimento; si delimitano con una matita nera i limiti della

banda lungo i margini di fluorescenza.

5.2.6.


Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale

asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di

cloroformio caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra aiutandosi con il

vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) collegata all'imbuto filtrante.

Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml per volta) raccogliendo

sempre il filtrato nella stessa beuta adattata all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di

circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previamente pesata,

si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche

goccia di acetone, si riporta ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105 oC indi si lascia

raffreddare in essiccatore e si pesa.

Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione sterolica.

5.3.


Preparazione dei trimetilsilileteri.

5.3.1.


Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per la sililazione, costituito da

una miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 4) in ragione di

50 ml per ogni milligrammo di steroli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 5).

Nota 4 - Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti

silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire

son uno stesso volume di piridina anidra.

5.3.2.

Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione degli

steroli. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni

minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.

Nota 5 - L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcun

disturbo. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio

della presenza di umidità o di alterazione del reattivo. In questo caso la prova dovrà essere

ripetuta.

5.4.

Analisi gascromatografica.



5.4.1.

Operazioni preliminari, condizionamento della colonna.

5.4.1.1.

Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso all'evaporatore

connesso col sistema di splittaggio e il terminale di uscita al rivelatore.

Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas,

efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.).

5.4.1.2.

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento.

Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso

gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di

almeno 20 oC superiore a quella di esercizio (nota 6). Si mantiene tale temperatura per almeno 2

ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e

dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico, regolazione

della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il

segnale ad una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il

tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve

presentare deriva.

Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva

positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

Nota 6 - La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 oC

alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato.

5.4.2.

Scelta delle condizioni operative.

5.4.2.1.

Condizioni operative di massima sono le seguenti:

- temperatura della colonna: 260 oC p5 oC

- temperatura dell'evaporatore: 280 oC

- temperatura del rivelatore: 290 oC

- velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno 30 + 50 cm/s

- rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100

- sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima

- sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV f.s.

- velocità della carta: 30 + 60 cm/ora

- quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 ml di soluzione di TMSE.

Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del

gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:

- il tempo di ritenzione del b-sitosterolo deve essere 20 p5 minuti

- il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto medio 3 %) 15 p5 % del

fondo scala, per l'olio di soia (contenuto medio 20 %) 80 p10 % del fondo scala

- si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario che i picchi oltre che separati

siano anche completamente risolti cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima

dell'uscita del picco successivo. È tuttavia tollerata anche una risoluzione incompleta a condizione

però che sia quantificabile secondo la perpendicolare il picco a TRR 1,02.

5.4.3.

Esecuzione dell'analisi.

5.4.3.1.

Con la microsiringa da 10 ml si preleva 1 ml di esano, si aspirano 0,5 ml di aria e successivamente

0,5 + 1 ml della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago

sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e dopo 1-2

secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi.

5.4.3.2.

Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli steroli presenti.

La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.4.1.2.).

5.4.4.

Identificazione dei picchi.

L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con

miscele di TMSE degli steroli, analizzate nelle medesime condizioni.

Gli steroli vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, brassicasterolo,

24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo, stigmasterolo, D)-campesterolo, D&

,$=-stigmastadienolo, clerosterolo, b-sitosterolo, sitostanolo, D& --avenasterolo, D&

,$%-stigmastadienolo, D)-stigmastenolo, D)-avenasterolo.

Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al sitosterolo per le colonne SE 52 e SE

54.


Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli.

5.4.5.


Valutazione quantitativa.

5.4.5.1.

Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'a-colestanolo e degli steroli. Non

vengono considerati i picchi di eventuali componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella

I. Il coefficiente di risposta dell'a-colestanolo si deve intendere unitario.

5.4.5.2.

Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza grassa, come segue:

sterolo x = Ax · ms · 100

sterolo x =

Ax . ms · 100

As · m

in cui:


Ax = area del picco dello sterolo x, in millimetri quadrati;

As

=



area del picco dell' á-colestanolo, in millimetri quadrati;

ms

=



massa di á-colestanolo aggiunta, in milligrammi;

m

=



massa del campione prelevato per la determinazione, in grammi.

6.


ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1


Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza grassa e, come steroli totali, la

loro somma.

6.2

Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco



corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi degli steroli.

% Dello sterolo x = ÓA . 100

% dello sterolo x =

Ax

ÓA



. 100

in cui:


Ax = Area del picco x,

ÓA

=



Sommatoria delle aree di tutti i picchi.

APPENDICE Determinazione della velocità lineare dei gas

Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1 + 3 ml di metano (o

propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento

dell'iniezione al momento dell'uscita del picco (tM).

La velocità lineare in cm/s è data da L/tMin cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tMè il

tempo cronometato in secondi.

Tabella I

Tempi di ritenzione relativi degli steroli

AE-5,23-stigmastadienolo

Picco

Identificazione



Tempo di ritenzione relativo

Colonna


SE 54

Colonna


SE 52

1

colesterolo



D-5-colesten-3b-olo

0,67


0,63

2

colestanolo



5a-colestan-3b-olo

0,68


0,64

3

brassicasterolo



[24S]-24-metil9D>D-5,22-colestadien-3b-olo

0,73


0,71

4

24-metilencolesterolo



24-metilen9D>D-5,24-colestadien-3b-olo

0,82


0,80

5

campesterolo



[24R]-24-metil9D>D-5-colesten-3b-olo

0,83


0,81

6

campestanolo



[24R]-24-metil-colestan-3b-olo

0,85


0,82

7

stigmasterolo



[24S]-24-etil9D>D-5,22-colestadien-3b-olo

0,88


0,87

8

D-7-campesterolo



[24R]-24-metil9D>D-7-colesten-3b-olo

0,93


0,92

9

D-5,23-stigmastadienolo



[24R,S]-24-etil9D>D-5,23-colestadien-3b-olo

0,95


0,95

10

clerosterolo



[24S]-24-etil9D>D-5,25-colestadien-3b-olo

0,96


0,96

11

b-sitosterolo



[24R]-24-etil9D>D-5-colesten-3b-olo

1,00


1,00

12

sitostanolo



24-etil-colestan-3b-olo

1,02


1,02

13

D-5-avenasterolo



[24Z]-24-etiliden-5-colesten-3b-olo

1,03


1,03

14

D-5,24-stigmastadienolo



[24R,S]-24-etil9D>D-5,24-colestadien-3b-olo

1,08


1,08

15

D-7-stigmastenolo



[24R,S]-24-etil9D>D-7-colesten-3b-olo

1,12


1,12

16

D-7-avenasterolo



[24Z]-24-etiliden9D>D-7-colesten-3b-olo

1,16


1,16

ALLEGATO VI

DETERMINAZIONE DELL'ERITRODIOLO E DELL'UVAOLO PREMESSA

L'eritrodiolo (convenzionalmente inteso come l'insieme dei dioli eritrodiolo ed uvaolo) è un

costituente dell'insaponificabile, caratteristico di alcune specie di sostanze grasse. La sua

concentrazione risulta notevolmente più elevata negli oli di oliva di estrazione rispetto ad altri oli

che lo contengono (oli di oliva di pressione, oli di vinaccioli) e pertanto la sua determinazione può

servire per accertare la presenza di olio di oliva di estrazione.

1.

OGGETTO


Il metodo descrive il procedimento per la determinazione dell'eritrodiolo nelle sostanze grasse.

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa viene saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi si

estrae l'insaponificabile con etere etilico e lo si purifica per passaggio su colonna di allumina.

Si procede al frazionamento dell'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile su placca

di gel di silice e si isolano la banda della frazione sterolica e quella dell'eritrodiolo.

Gli steroli e l'eritrodiolo, recuperati dalla placca vengono trasformati in trimetilsilileteri, la miscela è

quindi analizzata mediante gascromatografia.

Il risultato è espresso in percento di eritrodiolo rispetto all'insieme eritrodiolo + steroli.

3.

APPARECCHIATURA



3.1.

Apparecchiature prescritte nel metodo all'allegato V (Determinazione del contenuto degli steroli).

4.

REAGENTI


4.1.

Reagenti prescritti nel metodo all'allegato V (determinazione del contenuto degli steroli).

4.2.

Soluzione di riferimento di eritrodiolo, allo 0,5 % in cloroformio.



5.

PROCEDIMENTO

5.1.

Preparazione dell'insaponificabile.



Si procede come descritto al paragrafo 5.1.2. del metodo all'allegato V.

5.2.


Separazione dell'eritrodiolo e degli steroli.

5.2.1.


Vedi paragrafo 5.2.1. del metodo all'allegato V.

5.2.2.


Vedi paragrafo 5.2.2. del metodo all'allegato V.

5.2.3.


Si prepara una soluzione al 5 % in cloroformio dell'insaponificabile.

Con la microsiringa da 0,1 ml, si depositano su una placca cromatografica, a circa 1,5 cm dal

bordo inferiore, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. Ad una

estremità della placca si depositano, come riferimento, alcuni microlitri delle soluzioni di colesterolo

e di eritrodiolo.

5.2.4.


Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto al paragrafo 5.2.1. La

temperatura ambiente deve essere di circa 20 oC. Si chiude subito col coperchio e si eluisce fino a

che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove la

placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda.

5.2.5.

Si spruzza la placca uniformemente con la soluzione alcolica di 2m,7m-diclorofluoresceina.

Esaminando la placca alla luce ultravioletta si individuano le bande degli steroli e dell'eritrodiolo in

base all'allineamento con i riferimenti, e si delimitano con una punta leggermente al di fuori dei

margini di fluorescenza.

5.2.6.


Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nelle aree delimitate. Il materiale

asportato dalla placca viene riunito in bevuta da 50 ml; si aggiungono 15 ml di cloroformio caldo,

si agita bene e si filtra sull'imbuto a setto poroso trasferendo il gel di silice sul filtro stesso. Si lava

per tre volte con porzioni di 10 ml di cloroformio caldo per volta, raccogliendo il filtrato in

palloncino da 100 ml. Si evapora fino ad un volume di 4-5 ml, si trasferisce in provetta da

centrifuga a fondo conico da 10 ml previamente tarata, si porta a secco con blando riscaldamento

in corrente di azoto e si pesa.

5.3.


Preparazione dei trimetilsilileteri.

Si procede come descritto al paragrafo 5.3 del metodo all'allegato V.

5.4.

Analisi gascromatografica.



Si procede come descritto al paragrafo 5.4 del suddetto metodo. Le condizioni operative

dell'analisi gascromatografica devono essere tali che, oltre a soddisfare i requisiti richiesti per

l'analisi degli steroli, portino anche alla separazione dei TMSE dell'eritrodiolo e dell'uvaolo.

Iniettato il campione si lascia svolgere la carta fino a che siano stati eluiti gli steroli presenti,

l'eritrodiolo e l'uvaolo; si identificano quindi i picchi (l'eritrodiolo e l'uvaolo hanno tempi di

ritenzione relativi, rispetto al b-sitosterolo, di circa 1,45 e 1,55 rispettivamente) e se ne calcolano

le aree come detto per gli steroli.

6.


ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Eritrodiolo, % = A1 + A2 + Ó Asteroli · 100

Eritrodiolo, % =

A1 + A2


A1 + A2 + Ó Asteroli

· 100


in cui:

A1

= area del picco dell'eritrodiolo, in mm²,



A2

= area del picco dell'uvaolo, in mm²,

Ó Asteroli

= somma delle aree degli steroli presenti, in mm².

Il risultato si esprime con una cifra decimale.
ALLEGATO VII

DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI IN POSIZIONE 2 NEL TRIGLICERIDE 1.

OGGETTO

Si tratta di un metodo per la determinazione della composizione di quella frazione degli acidi grassi

di un olio o di un grasso che viene esterificata nella posizione 2 (oppure posizione interna) del

glicerolo.

2.

CAMPO D'APPLICAZIONE



Il presente metodo è applicabile agli oli e ai grassi aventi un punto di fusione inferiore ai 45 oC, a

causa delle caratteristiche dell'azione della lipasi pancreatica.

Esso non si può applicare indiscriminatamente agli oli e ai grassi contenenti quantitativi sostanziali

di: acidi grassi con 12 atomi di carbonio o meno (oli di noci di cocco e di semi di palma, grasso

butirrico), o acidi grassi insaturi (con oltre quattro doppi legami) contenenti 20 o più atomi di

carbonio (oli di pesce e di animali marini), oppure acidi grassi contenenti gruppi ossigenati diversi

dal gruppo acido.

3.


PRINCIPIO

Eventuale neutralizzazione di oli e grassi acidi in un solvente. Purificazione filtrando attraverso una

colonna di allumina. Idrolisi parziale dei trigliceridi a opera della lipasi pancreatica in un periodo

determinato. Separazione dei monogliceridi formatisi mediante cromatografia su strato sottile e

metanolisi degli stessi. Analisi di questi esteri metilici mediante cromatografia gas-liquido.

4.


APPARECCHIATURA

4.1.


Pallone a fondo arrotondato, da 100 ml.

4.2.


Pallone a fondo arrotondato, da 25 ml, con giunto smerigliato.

4.3.


Condensatore ad aria, di 1 m di lunghezza, idoneo ad essere montato sul pallone a 4.2.

4.4.


Beuta da 250 ml.

4.5.


Bicchiere da 50 ml.

4.6.


Imbuto separatore da 500 ml.

4.7.


Colonna di vetro per cromatografia, avente un diametro interno di 13 mm, una lunghezza di 400

mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto.

PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 391R2568.14.8.

Provetta da centrifuga di 10 ml, provvista di tappo di vetro smerigliato.

4.9.

Buretta da 5 ml, graduata in 0,05 ml.



4.10.

Siringa ipodermica da 1 ml, provvista di ago sottile.

4.11.

Microsiringa, idonea a rilasciare gocce di 3-4 ml.



4.12.

Diffusore per cromatografia su strato sottile.

4.13.

Piastre di vetro per cromatografia su strato sottile, 20 × 20 cm.



4.14.

Vaschetta di sviluppo in vetro per cromatografia su strato sottile, con coperchio a smeriglio,

idoneo per le piastre 20 × 20.

4.15.


Spray per cromatografia su strato sottile.

4.16.


Stufa regolata a 103 p2 oC.

4.17.


Termostato regolabile tra 30 e 45 oC con un'approssimazione di 0,5 oC.

4.18.


Evaporatore rotante.

4.19.


Vibratore elettrico, che consenta un'agitazione vigorosa delle provette da centrifuga.

4.20.


Lampada a ultravioletto per l'esame delle piastre di strato sottile.

Inoltre, per il controllo dell'attività della lipasi:

4.21.

pH metro.



4.22.

Agitatore a spirale.

4.23.

Buretta da 5 ml.



4.24.

Cronometro.

Inoltre, per l'eventuale preparazione della lipasi:

4.25.


Agitatore da laboratorio, idoneo per la dispersione e la miscela di materiali eterogenei.

5.


REAGENTI

5.1.


n-esano oppure, in mancanza di quest'ultimo, etere di petrolio (p. eb. 30-50 oC), di qualità per

cromatografia.

5.2.

2-propanolo, oppure etanolo, al 95 % (V/V), di qualità per reagente analitico.



5.3.

2-propanolo, oppure etanolo, soluzione acquosa 1/1.

5.4.

Etere etilico, esente da perossidi.



5.5.

Acetone.

5.6.

Acido formico, almeno al 98 % (m/m).



5.7.

Solvente di sviluppo: miscela di n-esano (5.1), etere etilico (5.4) ed acido formico (5.6) in

proporzioni 70/30/1 (V/V/V).

5.8.


Allumina attivata per cromatografia, neutra, grado Brockmann I.

5.9.


Polvere di silice, con legante, di qualità idonea alla cromatografia su strato sottile.

5.10.


Lipasi pancreatica di qualità adeguata (nota 1, nota 2).

5.11.


Idrossido di sodio, soluzione acquosa di 120 g/l.

5.13.


Cloruro di calcio (CaCl2), soluzione acquosa di 220 g/l.

5.14.


Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 1 g/l.

5.15.


Soluzione tampone: soluzione acquosa 1 M di tris-idrossimetilamminometano, portata a pH 8

mediante aggiunta di acido cloridrico (5.12) (controllare col potenziometro).

5.16.

Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95 % (V/V).



5.17.

2m,7m-diclorofluoresceina, soluzione di 2 g/l in etanolo al 95 % (V/V), resa leggermente alcalina

mediante aggiunta di 1 goccia di soluzione di idrossido di sodio 1 N per 100 ml.

Inoltre, per il controllo dell'attività lipasica:

5.18.

Olio neutralizzato.



5.19.

Idrossido di sodio, soluzione acquosa 0,1 N.

5.20.

Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa di 200 g/l.



5.21.

Gomma arabica, soluzione acquosa di 100 g/l.

6.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE



Se il campione ha un'acidità inferiore al 3 %, determinata conformemente all'allegato II, purificare

direttamente su allumina conformemente al punto 6.2. Se il campione ha un'acidità superiore al 3

%, determinata conformemente all'allegato II, neutralizzare con alcali in presenza di un solvente

conformemente al punto 6.1, quindi passare su allumina conformemente al punto 6.2.

6.1.

Neutralizzazione con alcali in presenza di solvente.



In un imbuto separatore (4.6) introdurre circa 10 g dell'olio grezzo e aggiungere 100 ml di esano

(5.1), 50 ml di 2-propanolo (5.2), poche gocce di soluzione di fenolftaleina (5.16) e un

quantitativo di soluzione di idrossido di sodio (5.11) corrispondente all'acidità libera dell'olio, oltre

a uno 0,3 % in eccesso. Agitare vigorosamente per 1 minuto, aggiungere 50 ml di acqua distillata,

agitare di nuovo e lasciar riposare.

Dopo la separazione, rimuovere lo strato di sapone che si trova sul fondo. Rimuovere altresì

eventuali strati intermedi (mucillagine, sostanza insolubile). Lavare la soluzione di esano dell'olio

neutralizzato

con successive porzioni da 25-30 ml della soluzione di 2-propanolo (5.3) finché il colore rosa

della fenolftaleina scompare. Eliminare la maggior parte dell'esano mediante distillazione sotto

vuoto nell'evaporatore rotante (4.18), essiccare l'olio a 30-40 oC sotto vuoto con l'ausilio di una

corrente di azoto puro finché l'esano è stato completamente rimosso.

6.2.

Purificazione mediante allumina.



Preparare una sospensione di 15 g di allumina attivata (5.8) in 50 ml di esano (5.1) e versarla,

agitando, sulla colonna cromatografica (4.7). Lasciare che l'allumina si depositi uniformemente e

che il solvente scenda ad 1-2 mm sopra l'assorbente. Versare cautamente sulla colonna una

soluzione di 5 g di olio in 25 ml di esano (5.1); raccogliere la totalità dell'effluente dalla colonna in

un pallone a fondo arrotondato (4.1).

7.


PREPARAZIONE DELLE PIASTRE CROMATOGRAFICHE

Pulire accuratamente le piastre di vetro (4.13) con etanolo, etere di petrolio ed acetone per

eliminare qualsiasi traccia di sostanza grassa. In una beuta (4.4) versare 30 g di polvere di silice

(5.9). Aggiungere 60 ml di acqua distillata. Tappare ed agitare fortemente per 1 minuto. Trasferire

immediatamente l'impasto nel diffusore (4.12) e coprire le piastre pulite con uno strato di 0,25

mm.


Essiccare le piastre all'aria per 15 minuti e successivamente per un'ora nella stufa (4.16) a 103 p2

oC. Raffreddare le piastre in un essiccatore a temperatura ambiente prima dell'uso.

Sono disponibili in commercio piastre preparate.

8.


PROCEDIMENTO

8.1.


Idrolisi con lipasi pancreatica.

In una provetta da centrifuga (4.8) pesare circa 0,1 g del campione preparato: se si tratta di grasso

solido, si scioglie con 0,2 ml di esano (5.1), scaldando leggermente se necessario. Aggiungere 20

mg di lipasi (5.10) e 2 ml della soluzione tampone (5.15). Agitare energicamente, ma con cautela e

aggiungere successivamente 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (5.14) e 0,2 ml della

soluzione di cloruro di calcio (5.13). Chiudere la provetta con il tappo smerigliato, agitare con

cautela (evitare di bagnare il tappo), inserire la provetta immediatamente nel termostato (4.17)

mantenuto a 40 p0,5 oC ed agitare manualmente per esattamente 1 minuto.

Togliere la provetta dal termostato ed agitare vigorosamente mediante agitatore elettrico (4.19)

per esattamente 2 minuti.

Raffreddare immediatamente in acqua corrente; aggiungere 1 ml di acido cloridrico (5.12) ed 1 ml

di etere etilico (5.4). Tappare e agitare vigorosamente mediante l'agitatore elettrico. Lasciar

riposare e rimuovere lo strato organico per mezzo della siringa (4.10), se necessario dopo aver

centrifugato.

8.2.

Separazione dei monogliceridi mediante cromatografia su strato sottile.



Applicare l'estratto sulla piastra cromatografica con la microsiringa (4.11), a circa 1,5 cm dal

bordo inferiore, in una linea sottile, uniforme, il più stretta possibile. Sistemare la piastra nella

vaschetta di sviluppo ben saturata (4.14) e sviluppare col solvente di sviluppo (5.7) a circa 20 oC,

fino a circa 1 cm dal bordo superiore della piastra.

Essiccare la piastra all'aria alla temperatura della vaschetta e spruzzare con la soluzione di

2m,7m-diclorofluoresceina (5.17). Identificare la banda del monogliceride (Rfcirca 0,035) sotto

luce ultravioletta (4.20).

8.3.


Analisi dei monogliceridi mediante cromatografia gas-liquido.

Rimuovere la banda ottenuta al punto 8.2 mediante una spatola (evitare di rimuovere i componenti

che restano sulla linea di base) e trasferire nel pallone di metilazione (4.2).

Trattare la silice raccolta direttamente come descritto all'allegato X-B alternativo in modo da

trasformare i monogliceridi in esteri metilici ed esaminare quindi gli esteri mediante

gascromatografia come descritto all'allegato X-A.

9.

ESPRESSIONE DEI RISULTATI



Calcolare la composizione dell'acido grasso nella posizione 2 con una decimale (nota 3).

10.


NOTE

Nota 1: Controllo dell'attività della lipasi

Preparare una emulsione oleosa agitando una miscela di 165 ml della soluzione di gomma arabica

(5.21), 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio neutralizzato (5.18) in un agitatore adeguato.

In un bicchiere (4.5) versare 10 ml di questa emulsione, seguiti da 0,3 ml della soluzione di colato

di sodio (5.20) e 20 ml di acqua distillata.

Sistemare il bicchiere in un termostato mantenuto a 37 p0,5 oC (nota 4); inserire gli elettrodi di un

pHmetro (4.21) e un agitatore a spirale (4.22). Mediante una buretta (4.23) aggiungere goccia a

goccia la soluzione di idrossido di sodio (5.19) fino a pH 8,5.

Aggiungere un quantitativo sufficiente di una sospensione acquosa della lipasi (vedasi sotto). Non

appena il pHmetro indica un pH di 8,3, avviare il cronometro (4.24) e farvi gocciolare la soluzione

di idrossido di sodio (5.19) in modo da mantenere il pH a 8,3. Leggere il volume di soluzione

alcalina consumata ogni minuto.

Registrare le osservazioni sotto forma di grafico, indicando le letture di tempo nelle ascisse e i ml di

soluzione alcalina necessari per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un

grafico lineare.

La sospensione di lipasi di cui sopra è una sospensione in acqua all'1 per mille (m/m). Per ciascuna

prova dev'essere usato un quantitativo sufficiente di questa sospensione in modo che venga

consumato in 4 o 5 minuti circa 1 ml della soluzione alcalina. Di solito sono necessari da 1 a 5 mg

della polvere. L'unità di lipasi viene definita come il quantitativo di enzima che libera 10

m-equivalenti di acido per minuto. Pertanto l'attività A della polvere usata, misurata in unità di

lipasi per mg, è indicata dalla formula seguente:

Nota 1: A = V × 10

A =


V × 10

m

dove V è il numero della soluzione di idrossido di sodio (5.19) consumato per minuto, desunto dal



grafico;

m è la massa, in mg, dell'aliquota della polvere da analizzare.

Nota 2: Preparazione della lipasi

Sono disponibili in commercio lipasi aventi un'attività lipasica soddisfacente. Tuttavia è possibile

prepararle in laboratorio come segue: Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 oC;

rimuovere il grasso solido circostante e il tessuto connettivo e triturare in un mescolatore in modo

da ottenere un fluido pastoso. Mescolare questa pasta con l'agitatore (4.25) per 4-6 ore con 2,5 l

di acetone anidro e centrifugare. Esterarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di

acetone, poi due volte con una miscela 1/1 (V/V) di acetone e di etere etilico e due volte con etere

etilico. Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da

conservare in frigorifero.

Nota 3: In ogni caso è consigliabile determinare la composizione degli acidi grassi totali dello

stesso campione, dato che il confronto con quelli degli acidi nella posizione 2 contribuirà

all'interpretazione dei dati ottenuti.

Nota 4: La temperatura di idrolisi è fissata a 37 oC, dato che si usa un olio liquido. Tuttavia essa

viene fissata a 40 oC per il campione da analizzare, in modo da consentire l'esame di grassi aventi

punti di fusione superiori a 45 oC.
ALLEGATO VIII

DETERMINAZIONE DEL CONVENUTO DI TRILINOLEINA 1.

OGGETTO

Si tratta di un metodo di separazione e determinazione quantitativa della composizione di

trigliceridi degli oli vegetali a seconda del loro peso molecolare e grado di insaturazione, in

funzione del rispettivo numero di carbonio equivalente (vedi nota 1).

2.

CAMPO D'APPLICAZIONE



Il presente metodo si applica a tutti gli oli vegetali contenenti trigliceridi di acidi grassi a catena

lunga. Il metodo si applica soprattutto per individuare la presenza di piccoli quantitativi di oli

semisiccativi (ricchi di acido linoleico) in oli vegetali contenenti acido oleico come acido grasso

insaturo predominante, quale l'olio d'oliva.

3.

PRINCIPIO



Separazione di trigliceridi, a seconda del loro numero di carbonio equivalente, mediante la

cromatografia liquida ad alte prestazioni (polarità di fase inversa) ed interpretazione dei

cromatogrammi.

4.


APPARECCHIATURA

4.1.


Cromatografo liquido ad alte prestazioni, che consente un controllo termostatico della temperatura

della colonna.

4.2.

Unità di iniezione da 10 ml.



4.3.

Rivelatore: rifrattometro differenziale. La sensibilità su tutta la scala non deve essere inferiore a

10-4 unità di indice di rifrazione.

4.4.


Colonna: tubo in acciaio inossidabile da 250 mm di lunghezza e 4,5 mm di diametro interno,

riempito di particelle di silice aventi un diametro di 5 mm, con il 22-23 % di carbonio sotto forma

di octadecilsilano (nota 2).

4.5.


Registratore e/o integratore.

5.


REAGENTI

I reagenti devono essere di purezza per analisi. I solventi di eluizione devono essere degassati e

possono essere riciclati parecchie volte senza ripercussioni sulle separazioni.

5.1.


Cloroformio.

5.2.


Acetone.

5.3.


Acetonitrile.

5.4.


Solvente di eluizione: Acetonitrile + acetone (proporzioni da modificare in modo da ottenere la

separazione desiderata; cominciare con miscela 50 : 50).

5.5.

Solvente di solubilizzazione: acetone oppure miscela acetone-cloroformio 1 : 1.



5.6.

Trigliceridi di riferimento: è possibile usare o trigliceridi commerciali (tripalmitina, trioleina ecc.) e,

in questo caso, i tempi di ritenzione vengono portati in grafico in conformità con il numero di

carbonio equivalente oppure, alternativamente, è possibile ottenere un cromatogramma di

riferimento dall'olio di soia (vedi note 3, 4 e figure 1 e 2).

6.


PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

Una soluzione al 5 % dei campioni da analizzare viene preparata pesando 0,5 p0,001 g del

campione in un pallone graduato da 10 ml e portando a 10 ml con il solvente di solubilizzazione

(5.5).


7.

PROCEDIMENTO

7.1.

Allestire il sistema cromatografico. Far passare il solvente di eluizione (5.4) alla velocità di 1,5



ml/mm in modo da pulire l'intero sistema. Aspettare finché la linea di base rimane stabile.

Iniettare 10 ml del campione preparato come al punto (6).

8.

CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI



Usare il metodo di standardizzazione interno, cioè assumere che la somma delle aree dei picchi

corrispondente ai vari trigliceridi sia eguale al 100 %. Calcolare la percentuale relativa di ciascun

trigliceride usando la seguente formula:

% di trigliceride = somma delle aree dei picchi × 100,

% di trigliceride =

area del picco

somma delle aree dei picchi

× 100,


esprimendo il risultato con una decimale.

Nota 1: L'ordine di eluzione può essere determinato calcolando i numeri di carbonio equivalente,

spesso definiti dalla relazione ECN = CN - 2n, dove CN è il numero di carbonio ed n è il numero

di doppi legami; esso può essere calcolato più precisamente tenendo conto dell'origine del legame

doppio.

Se no, n1 e n1n sono i numeri di legami doppi attribuibili rispettivamente all'acido oleico, linoleico

e linolenico, il numero di carbonio equivalente può essere calcolato mediante una relazione del

tipo:


ENC = CN - do no - d1n1 - d1nn1n

dove i coefficienti do, d1 e d1n possono essere calcolati mediante i trigliceridi di riferimento. Nelle

condizioni specificate nel presente metodo la relazione ottenuta sarà strettamente simile a:

ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 n1] - [2,17 n1n]

Nota 2: Esempi: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333;

Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, o similari.

Nota 3: Con parecchi trigliceridi di riferimento è possibile altresì calcolare la risoluzione rispetto

alla trioleina, á = RTm / RTmdi oleina usando il tempo di ritenzione corretto RTm = RT -

RTsolvente

Il grafico del log á in funzione di f (numero di doppi legami) consente di determinare i valori di

ritenzione di tutti i trigliceridi di acidi grassi contenuti nei trigliceridi di riferimento - vedi figura 2.

Nota 4: L'efficienza della colonna deve permettere la netta separazione del picco della LLL

(trilinoleina) da quelli dei trigliceridi con Tr adiacente.

POO
PPO


POO
PPO

ALLEGATO IX

ANALISI SPETTROFOTOMETRICA NELL'ULTRAVIOLETTO PREMESSA

L'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto può fornire indicazioni sulla qualità di una sostanza

grassa, sul suo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte da processi tecnologici.

Gli assorbimenti alle lunghezze d'onda previste nel metodo sono dovuti alla presenza di sistemi

dienici e trienici coniugati. I valori di tali assorbimenti sono espressi come estinzione specifica E 1

% 1 cm (estinzione di una soluzione della sostanza grassa all'1 % nel solvente prescritto, in

spessore di 1 cm) convenzionalmente indicata con K, (detto anche coefficiente di estinzione).

1.


OGGETTO

Il metodo descrive il procedimento per l'esecuzione dell'esame spettrofotometrico nell'ultravioletto

delle sostanze grasse.

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene disciolta nel solvente richiesto, quindi si determina l'estinzione

della soluzione alle lunghezze d'onda prescritte, in riferimento al solvente puro. Dalle letture

spettrofotometriche si calcolano le estinzioni specifiche.

3.

APPARECCHIATURA



3.1.

Spettrofotometro per misure di estinzione nell'ultravioletto fra 220 e 360 nm, con possibilità di

lettura per ogni unità nanometrica.

3.2.


Vaschette di quarzo prismatiche, con coperchio, di percorso ottico da 1 cm. Le vaschette,

riempite di acqua o altro solvente idoneo, non devono presentare fra di loro differenze superiori a

0,01 unità di estinzione.

3.3.


Matracci tarati da 25 ml.

3.4.


Colonna per cromatografia, avente lunghezza 450 mm e diametro 35 mm, con tubo di deflusso del

diametro di circa 10 mm.

4.

REAGENTI


4.1.

Isoottano (2,2,4 trimetilpentano) spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento

all'acqua distillata, trasmittanza non inferiore al 60 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm;

oppure


- Cicloesano spettrofotometricamente puro: deve avere, in riferimento all'acqua distillata,

trasmittanza non inferiore al 40 % a 220 nm e non inferiore al 95 % a 250 nm

oppure

- altro solvente idoneo, atto ad ottenere la completa solubilizzazione della sostanza grassa (es.



alcool etilico per l'olio di ricino).

4.2.


Allumina basica per cromatografia su colonna, preparata e controllata come descritto in

Appendice I.

4.3.

n-Esano, per cromatografia.



5.

PROCEDIMENTO

5.1.

Il campione in esame deve essere perfettamente omogeneo ed esente da impurezze sospese. Gli



oli liquidi a temperatura ambiente si filtrano su carta alla temperatura di circa 30 oC, i grassi

concreti vengono omogeneizzati e filtrati a temperatura superiore di non oltre 10 oC alla

temperatura di fusione.

5.2.


Del campione così preparato si pesano esattamente circa 0,25 g in matraccio tarato da 25 ml, si

porta a volume con il solvente prescritto e si omogeneizza. La soluzione risultante deve essere

perfettamente limpida. Qualora si riscontri opalescenza o torbidità si filtra rapidamente su carta.

5.3.


Con la soluzione ottenuta si riempie una vaschetta e si misurano le estinzioni, usando come

riferimento il solvente impiegato, alle lunghezze d'onda significative comprese fra 232 e 276 nm.

I valori di estinzione letti devono essere compresi nell'intervallo 0,1 p0,8; in caso contrario è

necessario ripetere le misure operando con soluzioni opportunamente più concentrate o più diluite.


5.4.

Qualora sia richiesta la determinazione dell'estinzione specifica dopo passaggio su allumina si

procede nel seguente modo: nella colonna cromatografica si introducono 30 g di allumina basica in

sospensione in esano; dopo assestamento dell'adsorbente si elimina l'eccesso di esano, sino ad 1

cm circa al disopra del livello superiore dell'allumina.

Si sciolgono 10 g di sostanza grassa, omogeneizzata e filtrata come descritto in 5.1., in 100 ml di

esano e si versa tale soluzione in colonna. Si raccoglie l'eluato e si evapora totalmente il solvente

sotto vuoto ad una temperatura inferiore ai 25 oC.

Sulla sostanza grassa così ottenuta si procede immediatamente come detto in 5.2.

6.


ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1.


Si riportano le estinzioni specifiche (coefficienti di estinzione) alle varie lunghezze d'onda calcolate

come segue:

Kl = c · s

Kl =


c · s


in cui:

Kë = estinzione specifica alla lunghezza d'onda l,

=

estinzione misurata alla lunghezza d'onda ë,



c

=

concentrazione della soluzione in g/100 ml,



s

=

spessore della vaschetta in cm.



I risultati si esprimono con due cifre decimali.

6.2.


L'esame spettrofotometrico dell'olio di oliva secondo il metodo ufficiale dei Regolamenti della CEE

prevede la determinazione dell'estinzione specifica, in soluzione in isoottano, alle lunghezze d'onda

di 232 e 270 nm e la determinazione del DK inteso come:

DK = Km - Km - 4 + Km + 4

DK = Km -

Km - 4 + Km + 4

2

in cui Km è l'estinzione specifica alla lunghezza d'onda m, lunghezza d'onda di massimo



assorbimento intorno a 270 nm.

APPENDICE I Preparazione dell'allumina e controllo dell'attività A1.1.

Preparazione dell'allumina

In un recipiente a chiusura ermetica si pone l'allumina preventivamente essiccata in forno a

380-400 oC per 3 ore, si aggiunge acqua distillata in ragione di 5 ml per 100 g di allumina, si

chiude subito il recipiente, si agita ripetutamente, quindi si lascia a riposo per almeno 12 ore prima

dell'uso.

A1.2.


Controllo dell'attività dell'allumina

Si prepara una colonna cromatografica con 30 g di allumina. Operando come descritto al

paragrafo 5.4. si fa passare attraverso la colonna una miscela costituita da:

- 95 % olio di oliva vergine, avente estinzione specifica a 268 nm inferiore a 0,18;

- 5 % olio di arachide trattato con terre nel processo di raffinazione, avente estinzione specifica a

268 nm uguale o superiore a 4.

Se la miscela dopo passaggio in colonna presenta estinzione specifica a 268 nm superiore a 0,11

l'allumina è accettabile, altrimenti deve essere aumentato il tasso di idratazione.

APPENDICE II Taratura dello spettrofotometro A2.

L'apparecchio deve essere controllato periodicamente (almeno ogni 6 mesi) sia per la rispondenza

della lunghezza d'onda che per l'esattezza della risposta.

A2.1.


Il controllo della lunghezza d'onda può essere fatto mediante la lampada a vapori di mercurio o

mediante gli appositi filtri.

A2.2.

Per il controllo della risposta della fotocellula e del fotomoltiplicatore si procede come segue: si



pesano 0,2000 g di potassio cromato puro per spettrofotometria e si sciolgono, in matraccio

tarato da 1 000 ml, in soluzione di idrossido di potassio 0,05 N diluendo poi a volume. Della

soluzione ottenuta si prelevano 25 ml esatti, si trasferiscono in matraccio tarato da 500 ml e si

diluisce ulteriormente a volume con la stessa soluzione di idrossido di potassio.

Della soluzione così ottenuta si misura l'estinzione a 275 nm, impiegando la soluzione di idrossido

di potassio come riferimento. L'estinzione misurata con vaschetta da 1 cm dovrà essere 0,200

p0,005.
ALLEGATO X A

ANALISI GASCROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI 1.


OGGETTO

Il presente metodo dà un orientamento generale per l'applicazione della gascromatografia, con

l'uso di colonne a riempimento o capillari, per determinare la composizione qualitativa e

quantitativa di una miscela di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta in conformità con il metodo

specificato nell'allegato X B.

Il metodo non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.

2.

REAGENTI


2.1.

Gas vettore

Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.) completamente essiccato ed avente un tenore di

ossigeno inferiore a 10 mg/kg.

Nota 1: L'idrogeno, che viene usato come gas vettore soltanto con colonne capillari, può

raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è pericoloso; sono disponibili dispositivi di sicurezza.

2.2.

Gas ausiliari



2.2.1.

Idrogeno (purezza ·99,9 %), esente da impurezze organiche.

2.2.2.

Aria od ossigeno, esente da impurezze organiche.

2.3.

Standard di riferimento



Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un grasso a composizione nota,

di preferenza analogo a quello della sostanza grassa da analizzare.

Sarà necessario l'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi.

3.


APPARECCHIATURA

Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchiatura per gascromatografia,

facendo uso di colonne a riempimento e/o capillari nonché di un rivelatore a ionizzazione di

fiamma. È consigliabile usare apparecchiatura in grado di garantire l'efficienza e la risoluzione

specificate al punto 4.1.2.

3.1.


Gascromatografo

Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.

3.1.1.

Sistema ad iniezione

Usare un sistema ad iniezione:

a) con colonne a riempimento, aventi lo spazio morto minore possibile (in questo caso il sistema di

iniezione deve poter essere riscaldato a una temperatura di 20-50 oC superiore a quella della

colonna) oppure

b) con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve essere appositamente progettato.

Esso può essere del tipo a separazione oppure del tipo non a separazione sull'iniettore della

colonna.

Nota 2: In assenza di acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio, può essere usato un

iniettore ad ago mobile.

3.1.2.


Stufa

La stufa deve essere atta a scaldare la colonna ad almeno 260 oC e a mantenere la temperatura

desiderata con l'approssimazione di 1 oC per la colonna a riempimento e con l'approssimazione di

0,1 oC per la colonna capillare.

Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una provetta di silice fusa.

Il ricorso al riscaldamento programmato è raccomandato in tutti i casi e in particolare per gli acidi

grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio.

3.1.3.


Colonna e riempimento

3.1.3.1.

Colonna costruita in materiale inerte alle sostanze da analizzare (cioè vetro o acciaio inossidabile) e

avente le seguenti dimensioni:

a) lunghezza: 1-3 m. Se sono presenti acidi grassi a catena lunga (oltre C20) dovrà essere usata

una colonna relativamente corta. Se invece si analizzano acidi a 4-6 atomi di carbonio, si

raccomanda di usare una colonna avente una lugnhezza di 2 m.

b) diametro interno: da 2 a 4 mm.

Nota 3: Se sono presenti componenti poliinsaturi aventi più di tre legami doppi, essi potranno

essere decomposti in una colonna di acciaio inossidabile.

Nota 4: Può essere usato un sistema di colonne a riempimento gemelle.

3.1.3.2.

Riempimento, comprendente i seguenti elementi:

a) supporto: terra di diatomee lavata con acido e silanizzata, oppure altro idoneo supporto inerte

con una gamma ristretta di granulometria (compresa tra 125 e 200 mm, con variazioni di p25

mm); la granulometria media è correlata al diametro interno e alla lunghezza della colonna;

b) fase stazionaria: tipo di poliestere di liquido polare (ad es. polisuccinato di dietilenglicole,

polisuccinato di butandiolo, poliadipato di etilenglicole ecc.), cianosiliconi o qualsiasi altro liquido

che consenta la separazione cromatografica richiesta (vedi clausola 5). La fase stazionaria deve

essere compresa tra il 5 % (m/m) e il 20 % (m/m) del riempimento. Per alcune separazioni può

essere usata una fase stazionaria non polare.

3.1.3.3.

Condizionamento della colonna

Con la colonna staccata, dalla parte del rivelatore, scaldare gradualmente la stufa a 185 oC e far

passare una corrente di gas inerte attraverso la colonna di recente preparata ad un flusso

compreso tra 20 ml/min e 60 ml/min per almeno 16 h a questa temperatura e per ulteriori 2 h a

195 oC.

3.1.4.


Colonna capillare

3.1.4.1.

Tubo costituito di materiale inerte alle sostanze da analizzare (di solito vetro o silice fusa). Il

diametro interno deve essere compreso tra 0,2 mm e 0,8 mm. La superficie interna deve esser

sottoposta a un opportuno trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima di

essere ricoperto con la fase stazionaria. Nella maggior parte dei casi è sufficiente una lunghezza di

25 mm.

3.1.4.2.

Fase stazionaria, di solito del tipo poliglicole [poli(etilenglicole) 20 000], poliestere (polisuccinato

di butandiolo) oppure polisilossano polare (cianosiliconi). Sono adatte le colonne legate

(cross-linked).

Nota 5: Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'identificazione e separazione

dell'acido linolenico e degli acidi a C20.

Le coperture devono essere sottili, ad esempio 0,1 mm-0,2 mm.

3.1.4.3.

Montaggio e condizionamento della colonna

Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle colonne capillari, ovvero

sistemazione della colonna nella stufa (supporto), scelta e collegamento di giunti (a tenuta stagna),

sistemazione delle estremità della colonna nell'iniettore e nel rivelatore (riduzione degli spazi morti).

Sottoporre la colonna ad un flusso di gas vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna avente

una lunghezza di 25 mm e un diametro interno di 0,3 mm].

Condizionare la colonna programmando la temperatura della stufa a 3 oC/min dalla temperatura

ambiente a una temperatura di 10 oC inferiore al limite di decomposizione della fase stazionaria.

Mantenere la stufa a questa temperatura per 1 h fino a stabilizzazione della linea di base. Riportarla

a 180 oC in modo da lavorare in condizioni di isotermicità.

Nota 6: Sono disponibili in commercio opportune colonne precondizionate.

3.1.5.

Rivelatore, di preferenza idoneo ad essere riscaldato a una temperatura superiore a quella della

colonna.

3.2.


Siringa

La siringa deve avere una capacità massima di 10 ml ed essere graduata in divisioni di 0,1 ml.

3.3.

Registratore



Se la curva di registrazione deve essere usata per calcolare la composizione della miscela

analizzata, è necessario un registratore elettronico di alta precisione compatibile con

l'apparecchiatura usata. Detto registratore deve avere le seguenti caratteristiche:

a) tasso di risposta, al di sotto di 1,5 s, di preferenza 1 s (il tasso di risposta è il periodo

necessario affinché la punta di registrazione passi dallo 0 % al 90 % a seguito dell'introduzione

improvvisa di un segnale del 100 %);

b) ampiezza della carta, minimo 20 cm;

c) velocità della carta, adattabile a valori compresi tra 0,4 cm/min e 2,5 cm/min.

3.4.

Integratore o calcolatore (facoltativo)



Un calcolo rapido ed accurato può essere effettuato con l'ausilio di un integratore o calcolatore

elettronico. Quest'ultimo deve dare una risposta lineare con una sensibilità adeguata e la correzione

della deviazione della linea di base deve essere soddisfacente.

4.


PROCEDIMENTO

Nelle operazioni descritte dal paragrafo 4.1 al paragrafo 4.3 si fa accenno all'uso di un rivelatore a

ionizzazione di fiamma.

Come alternativa può essere usato un gascromatografo munito di catarometro (che funziona in

base al principio della variazione di conducibilità termica). Le condizioni di funzionamento vengono

pertanto modificate come descritto nella clausola 6.

4.1.

Condizioni dell'analisi



4.1.1.

Selezione delle condizioni operative ottimali

4.1.1.1.

Colonna a riempimento

Nella scelta delle condizioni per effettuare la prova, devono essere prese in considerazione le

seguenti varianti:

a) la lunghezza ed il diametro della colonna;

b)

la natura e la quantità della fase stazionaria;



c)

la temperatura della colonna;

d)

il flusso di gas vettore;



e)

la risoluzione necessaria;

f)

le dimensioni del campione da analizzare, scelto in modo che il collegamento tra il rivelatore e



l'elettrometro diano una risposta lineare;

g)

la durata dell'analisi.



In linea di massima i valori riportati nella tabella 1 e nella tabella 2 danno i risultati auspicati, cioè

almeno 2 000 piatti teorici per metro di lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato

di metile, e l'eluizione dello stesso entro 15 minuti circa.

Se l'apparecchiatura lo consente, l'iniettore deve trovarsi a una temperatura di circa 200 oC ed il

rivelatore a una temperatura pari o superiore a quella della colonna.

Di norma, il rapporto tra il flusso dell'idrogeno fornito al rilevatore a ionizzatore di fiamma e quello

del gas vettore varia tra 1:2 e 1:1 in funzione del diametro della colonna. Il flusso dell'ossigeno è di

circa 5-10 volte quello dell'idrogeno.


Tabella 1
Diametro interno della colonna

mm

Flusso del gas vettore



ml/min

2

da 15 a 25



3

da 20 a 40

4

da 40 a 60



Tabella 2

Concentrazione della fase stazionaria

% (m/m)

Temperatura della colonna

oC

5

175



10

180


15

185


20

185
4.1.1.2.

Colonna capillare

Le caratteristiche di efficienza e di permeabilitá delle colonne capillari indicano che la separazione

tra i costituenti e la durata dell'analisi sono ampiamente dipendenti dal flusso del gas vettore nella

colonna. È pertanto necessario ottimizzare le condizioni operative influenzando questo parametro

(o più semplicemente la pressione di testa della colonna), a seconda che si desideri migliorare le

separazioni o effettuare un'analisi rapida.

4.1.2.

Determinazione del numero di piatti teorici (efficacia) e risoluzione (vedi figura 1)

Effettuare l'analisi di una miscela di stearato di metile e di oleato di metile in proporzioni più o

meno equivalenti (ad es. esteri metilici del burro di cacao).

Scegliere la temperatura della colonna e il flusso di gas vettore in modo che il massimo del picco

dello stearato di metile venga registrato circa 15 minuti dopo il picco del solvente. Usare un

quantitativo sufficiente della miscela di esteri metilici in modo che il picco dello stearato di metile

occupi circa tre quarti della scala intera.

Calcolare il numero dei piatti teorici, n (efficienza), con la formula:

n = 16 [ W (I) ]²

n = 16 [

dr (I)


W (I)

e la risoluzione R usando la formula:



R = W(I) + W (II)

R =


2D

W(I) + W (II)

dove:

dr (I)


= è la distanza di ritenzione, in millimetri, dall'inizio del cromatogramma fino al massimo del picco

dello stearato di metile;

W(I) e W(II)

= sono le ampiezze, in millimetri, del picchi rispettivamente dello stearato di metile e dell'oleato di

metile, misurati tra i punti d'intersezione delle tangenti ai punti di inflessione della curva con la linea

di base;

D

= è la distanza, in millimetri, tra i picchi massimi dello stearato di metile e dell'oleato di metile.



Le condizioni operative da scegliere sono quelle idonee ad almeno 2 000 piatti teorici per metro di

lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato di metile e una risoluzione di almeno

1,25.

4.2.


Sostanza da analizzare

Usando la siringa (3.2) prendere 0,1 ml-2 ml della soluzione di esteri metilici preparata

conformemente all'allegato X B e iniettarli nella colonna.

Nel caso di esteri non in soluzione, preparare una soluzione di circa 100 mg/ml in eptano di qualità

cromatografica ed iniettare da 0,1 ml a 1 ml di questa soluzione.

Se l'analisi riguarda costituenti presenti soltanto in tracce, la quantità di sostanza da analizzare può

essere aumentata (fino a 10 volte).

4.3.


Analisi

Di norma le condizioni operative sono quelle di cui al paragrafo 4.1.1.

È possibile tuttavia operare a una temperatura inferiore della colonna quando si tratta di

determinare acidi grassi aventi meno di 12 atomi di carbonio oppure a una temperatura più elevata

quando si tratta di determinare acidi grassi con oltre 20 atomi di carbonio. All'occasione, è

possibile programmare la temperatura in entrambi questi casi. Ad esempio, se il campione contiene

gli esteri metilici degli acidi grassi con meno di 12 atomi di carbonio, iniettare il campione a 100

oC (oppure da 50 oC a 60 oC se è presente acido butirrico) e raggiungere immediatamente la

temperatura a un tasso compreso tra 4 oC/min e 8 oC/min in condizioni ottimali. In taluni casi

possono essere associati i due procedimenti.

Dopo il riscaldamento programmato, continuare l'eluizione a temperatura costante finché tutti i

componenti sono stati eluiti. Se lo strumento non prevede il riscaldamento programmato, usarlo a

due temperature fisse comprese tra 100 oC e 195 oC.

Se necessario, si raccomanda di effettuare un'analisi su due fasi fisse a polarità differente per

verificare l'assenza di picchi mascherati, ad esempio nel caso della presenza contemporanea di

C18:3 e C20:0 oppure C18:3 e C18:2 associati.

4.4.

Preparazione del cromatogramma di riferimento e dei grafici di riferimento



Analizzare la miscela standard di riferimento (2.3) nelle stesse condizioni operative di quelle usate

per il campione e misurare i tempi di ritenzione o le distanze di ritenzione per gli acidi grassi

costituenti. Su carta semilogaritmica, per qualsiasi grado di insaturazione, costruire i grafici che

mostrano il logaritmo del tempo o della distanza di ritenzione in funzione del numero di atomi di

carbonio. In condizioni isotermiche, i grafici relativi ad acidi a catena lineare aventi lo stesso grado

di insaturazione devono essere linee rette. Queste linee devono essere all'incirca parallele.

È necessario evitare condizioni in cui si possano verificare i «picchi mascherati», ovvero nei quali la

risoluzione è insufficiente a separare due costituenti.

5.

ESPRESSIONE DEI RISULTATI



5.1.

Analisi qualitativa

Identificare i picchi dell'estere metilico del campione dai grafici preparati al paragrafo 4.4, se

necessario per interpolazione.

5.2.

Analisi quantitativa



5.2.1.

Determinazione della composizione

A parte casi eccezionali, usare il metodo di normalizzazione interno, cioè presumere che la totalità

dei componenti del campione siano rappresentati sul cromatogramma, in modo che il totale delle

aree sotto i picchi costituisca il 100 % dei costituenti (eluizione totale).

Se nell'apparecchiatura è previsto un integratore, usare i dati da esso ottenuti. In caso negativo,

determinare l'area sotto ciascun picco moltiplicando l'altezza del picco per l'ampiezza a metà

altezza e, se necessario, prendere in considerazione le varie attenuazioni usate durante la

registrazione.

5.2.2.


Metodo di calcolo

5.2.2.1.

Caso generale

Calcolare il contenuto di un dato componente I, espresso come percentuale in massa degli esteri

metilici, determinando la percentuale rappresentata dall'area del picco corrispondente relativa alla

somma delle aree di tutti i picchi, usando laformula seguente:

ÓA × 100

Ai

ÓA



× 100

dove


Ai = è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;

ÓA

= è la somma delle aree sotto tutti i picchi.



Esprimere il risultato con l'approssimazione di una decimale.

Nota 7: In questo caso generale, si ritiene che il risultato del calcolo basato sulle aree relative

rappresenti una percentuale in massa. Per i casi nei quali questa asserzione non è giustificata, vedi

5.2.2.2.

5.2.2.2.

Uso dei fattori di correzione

In taluni casi, ad esempio in presenza di acidi grassi aventi meno di 8 atomi di carbonio oppure di

acidi aventi gruppi secondari, quando si usano rivelatori di conduttività termica oppure quando è

necessario il grado più elevato di accuratezza, devono essere usati fattori di correzione che

convertano le percentuali delle aree e dei picchi in percentuali in peso dei componenti.

Determinare i fattori di correzione con l'ausilio di un cromatogramma derivato dall'analisi di una

miscela di riferimento di esteri metilici di composizione nota, effettuata in condizioni operative

identiche a quelle usate per il campione.

Per questa miscela di riferimento, la percentuale in peso del componente i è data dalla formula:

Óm × 100

mi

Óm



× 100

dove


mi = è il peso del componente i nella miscela di riferimento;

Óm

= è il totale delle masse dei vari componenti della miscela di riferimento.



Dal cromatogramma della miscela di riferimento (4.4) calcolare la percentuale (area/area) del

componente i come segue:

Ai

ÓA

× 100



dove

Ai

è l'area sotto il picco corrispondente al componente i,



ÓA

è la somma delle aree sotto tutti i picchi.

Il fattore di correzione viene quindi calcolato come segue:

Ki = mi × ÓA

Ki=

mi× ÓA


Ai× Óm

Di norma i fattori di correzione vengono espressi facendo riferimento a KC16 sicché i fattori

relativi diventano:

Kmi = KC 1 6

Kmi=

Ki

KC 1 6



Per il campione il contenuto di ciascun componente espresso come percentuale in degli esteri

metilici è:


Ó (Kmi × Ai) × 100

Kmi× Ai


Ó (Kmi× Ai)

× 100


Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.

5.2.2.3.

Uso di uno standard interno

In alcune analisi (ad es. quando non tutti gli acidi grassi sono quantificati, ad esempio quando sono

presenti acidi con 4 e 6 atomi di carbonio accanto ad acidi con 16 e 18 atomi di carbonio, oppure

quando è necessario determinare il quantitativo assoluto di un acido grasso in un campione) è

necessario ricorrere ad uno standard interno. Vengono spesso usati acidi grassi con 5,15 o 17

atomi di carbonio. Deve essere determinato l'eventuale fattore di correzione per lo standard

interno.

La percentuale in peso del componente i, espressa come esteri metilici, è data dalla formula:

ms × Kmi × Ai × 100

m5× Kmi× Ai

m × Kms× As

× 100
dove

Ai è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;

As

è l'area sotto il picco corrispondente allo standard interno;



Kmi

è il fattore di correzione per il componente i (relativo a KC 1 6);

Kms

è il fattore di correzione dello standard interno (relativo a KC 1 6);



m

è il peso, in milligrammi, della sostanza da analizzare;

ms

è il peso, in milligrammi, dello standard interno.



Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.

6.


CASO SPECIALE - USO DI UN CATAROMETRO (FUNZIONANTE IN BASE AL

PRINCIPIO DEI MUTAMENTI DI CONDUTTIVITÀ TERMICA)

Per la determinazione della composizione qualitativa e quantitativa di una miscela di esteri metilici

degli acidi grassi può essere usato altresì un gascromatografo associato a un rivelatore funzionante

in base al principio dei mutamenti di conduttività termica (catarometro). Se quest'ultimo viene

usato, le condizioni specificate alle clausole 3 e 4 devono essere modificate come indicato nella

tabella 3.

Per l'analisi quantitativa, usare i fattori di correzione definiti al paragrafo 5.2.2.2.


Tabella 3


Variabile

Valore/condizioni

Colonna

Lunghezza: da 2 m a 4 m

Diametro interno: 4 mm

Supporto


Granulometria compresa tra 160 ìm e 200 ìm

Concentrazione della fase stazionaria

Dal 15 % (m/m) al 25 % (m/m)

Gas vettore

Elio oppure, in mancanza di quest'ultimo, idrogeno, col tenore più basso possibile di ossigeno

Gas ausiliari

Nessuno

Temperatura dell'iniettore

Da 40 oC a 60 oC al di sopra di quella della colonna

Temperatura della colonna

Da 180 oC a 200 oC

Flusso del gas vettore

Di norma tra 60 ed 80 ml/min

Entità del campione di sostanza iniettato

Di norma tra 0,5 ìl e 2 ìl

7.


RELAZIONE SULLA PROVA
La relazione sulla prova deve specificare i metodi usati per la preparazione degli esteri metilici e

per l'analisi gascromatografica nonché i risultati tenuti. Essa deve citare altresì tutti i dettagli

operativi non specificati nella presente norma internazionale oppure considerati come facoltativi,

nonché i particolari di qualsiasi evento che possa avere influenzato i risultati.


La relazione sulla prova deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del

campione.


ALLEGATO X B

PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DI ACIDI GRASSI IN CONFORMITÀ

ALL'ALLEGATO VI - PUNTI I E II - DEL REGOLAMENTO (CEE) N. 72/77 DELLA

COMMISSIONE OPPURE IN ALTERNATIVA IL METODO SEGUENTE PREMESSA

La scelta del procedimento da seguire deve essere fatta in funzione della composizione acidica e

dell'acidità della sostanza grassa da esaminare e della analisi gascromatografica da effettuare.

In particolare:

- per sostanze grasse contenenti acidi grassi inferiori a C12, possono essere impiegati solo i

procedimenti in fiala chiusa o al solfato dimetilico;

- per sostanze grasse aventi acidità superiore al 3 % possono essere impiegati solo i procedimenti

al metanolo-acido cloridrico o al solfato di metilico;

- per determinazioni gascromatografiche di isomeri trans possono essere impiegati solo i

procedimenti al metilato sodico o al solfato dimetilico;

- il procedimento al metanolo-esano-acido solforico deve essere impiegato per la preparazione

degli esteri metilici di piccole quantità di sostanze grasse da separazioni per cromatografia su strato

sottile.

La presenza di insaponificabile può essere trascurata purché non superi il 3 %, altrimenti gli esteri

metilici dovranno essere preparati dagli acidi grassi.

1.

OGGETTO


Sono descritti cinque procedimenti per la preparazione degli esteri metilici da sostanze grasse:

a) con metilato sodico

b)

con metilato sodico in fiala chiusa



c)

con metanolo-acido cloridrico in fiala chiusa

d)

con solfato dimetilico



e)

con metanolo-esano-acido solforico.


Procedimento A

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene riscaldata a ricadere con alcool metilico e metilato sodico. Gli

esteri metilici ottenuti sono estratti con etere etilico.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Pallone da 100 ml con refrigerante a ricadere, munito all'estremità superiore di tubo a calce

sodata, con giunti a smeriglio.

3.2.

Cilindri graduati da 50 ml.



3.3.

Pipetta graduata da 5 ml, con divisioni in 0,1 ml.

3.4.

Imbuti separatori da 250 ml.



3.5.

Pallone da 200 ml.

4.

REAGENTI


4.1.

Metanolo anidro.

4.2.

Metilato sodico, soluzione all'1 % circa in metanolo; si prepara sciogliendo 0,34 g di sodio



metallico in 100 ml di metanolo anidro.

4.3.


Etere etilico.

4.4.


Sodio cloruro, soluzione 10 %.

4.5.


Etere di petrolio 40-60 oC.

5.


PROCEDIMENTO

5.1.


Nel pallone da 100 ml si introducono 2 g di sostanza grassa previamente disidratata su solfato

sodico e filtrata. Si aggiungono 35 ml di metanolo, si congiunge il refrigerante e si fa bollire a

ricadere per alcuni minuti.

5.2.


Si interrompe il riscaldamento, si stacca il refrigerante e si aggiungono rapidamente 3,5 ml di

soluzione di metilato sodico; si collega nuovamente il refrigerante e si fa bollire a riflusso per

almeno 3 ore. La metilazione deve ritenersi completa quando tutta la sostanza grassa è passata in

soluzione e la miscela di reazione è perfettamente limpida a temperatura ambiente.

5.3.

Si raffredda e si versa la miscela di reazione in un imbuto separatore da 250 ml, si aggiungono



35-40 ml di etere etilico, 100 ml di acqua e 5-6 ml di soluzione di cloruro sodico al 10 %. Si agita

e si lasciano separare gli strati; la fase acquosa viene trasferita in un secondo imbuto separatore ed

estratta nuovamente con 25 ml di etere etilico.

Agli estratti eterei, riuniti, si aggiungono 50 ml di etere di petrolio 40-60 oC; ciò provoca la

separazione di acqua che viene eliminata.

Si lava la fase eterea per 3 volta con porzioni di 10-15 ml di acqua, si essicca su solfato sodico e

si filtra su carta raccogliendo il filtrato nel pallone da 200 ml.

Si distilla il solvente, completandone l'allontanamento su bagnomaria in corrente di azoto puro.


Procedimento B

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene trattata con metilato sodico in soluzione metanolica, in fiala

chiusa, a 85-90 oC.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Fiala di vetro a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro 14-16 mm).

3.2.


Pipetta graduata da 1 ml con divisioni in 0,1 ml.

4.


REAGENTI

4.1.


Metilato sodico, soluzione all'1,5 % circa in metanolo. Si prepara sciogliendo 0,50 g di sodio

metallico in 100 ml di metanolo anidro.

5.

PROCEDIMENTO



5.1.

Nella fiala di vetro si introducono 2 g di sostanza grassa, previamente disidratata su solfato sodico

e filtrata. Si aggiungono 0,3 g (circa 0,4 ml) di soluzione di metilato sodico e si chiude la fiala alla

fiamma.


5.2.

Si mantiene la fiala per 2 ore in bagno a 85-90 oC agitando di tanto in tanto; l'avvenuta

esterificazione si rileva dalla limpidezza del contenuto della fiala dopo sedimentazione della

glicerina e del residuo dei reagenti.

5.3.

Si raffredda a temperatura ambiente. Si apre la fiala al momento dell'impiego degli esteri metilici.



Questi non richiedono altre manipolazioni prima dell'introduzione nel gascromatografo.
Procedimento C

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene trattata con metanolo-acido cloridrico, in fiala chiusa, a 100

oC.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Fiala di vetro, a pareti robuste, da circa 5 ml (altezza 40-45 mm, diametro 14-16 mm).

3.2.


Pipette tarate da 1 e 2 ml.

4.


REAGENTI

4.1.


Soluzione di acido cloridrico in metanolo al 2 %. Si prepara con acido cloridrico gassoso e

metanolo anidro (Nota 1).

4.2.

Esano per gascromatografia.



5.

PROCEDIMENTO

5.1.

Si introducono nella fiala di vetro 0,2 g di sostanza grassa, preventivamente disidratata su solfato



sodico e filtrata, e 2 ml di soluzione di acido cloridrico-metanolo. Si chiude la fiala alla fiamma.

5.2.


Si mantiene la fiala in bagno a 100 oC per 40 minuti.

5.3.


Si raffredda la fiala sotto acqua corrente, si apre, si aggiungono 2 ml di acqua distillata e 1 ml di

esano. Si centrifuga e si preleva la fase esanica che è pronta per l'impiego.


Procedimento D

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame viene saponificata con soluzione metilalcolica di potassio idrossido,

quindi trattata con solfato dimetilico. Dopo aggiunta di acido cloridrico, si ha separazione

spontanea degli esteri metilici formatisi. Mediante successivo trattamento con allumina, si

ottengono esteri metilici ad elevata purezza.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Provetta di vetro, a pareti robuste, capacità circa 20 ml, con tappo smerigliato 10/19, con ganci di

sicurezza.

3.2.

Refrigeranti a ricadere a 5 bolle, attacco a smeriglio 10/19.



3.3.

Filtri di vetro a setto poroso gradazione G 2, diametro 20 mm.

3.4.

Provette di vetro, capacità circa 10 ml, fondo conico.



3.5.

Siringhe da 1 ml e 5 ml.

4.

REAGENTI


4.1.

Potassio idrossido, soluzione al 10 % in alcool metilico per gascromatografia.

4.2.

Indicatore verde di bromocresolo: soluzione allo 0,05 % in alcool metilico.



4.3.

Solfato dimetilico (d = 1,335 a 15 oC).

4.4.

Acido cloridrico concentrato, d 1,19, diluito 1 + 1 con alcool metilico per gascromatografia.



4.5.

Ossido di alluminio standardizzato secondo Brockmann per cromatografia di adsorbimento.

5.

PROCEDIMENTO



5.1.

Si introducono nella provetta da 20 ml. (circa 2,2 ml) di sostanza grassa preventivamente

disidratata su solfato sodico e filtrata, si aggiungono 5 ml della soluzione di potassio idrossido e

alcuni granuli di quarzo per regolare l'ebollizione. Si applica il refrigerante a ricadere e si riscalda su

piccola fiamma per 5 minuti agitando: la saponificazione risulta comunque completa quando la

soluzione è limpida. Al termine, si raffredda con acqua corrente e si stacca il refrigerante.

5.2.

Si aggiungono 2 gocce di indicatore e, mediante siringa, 1 ml di solfato dimetilico, lentamente. Si



chiude ermeticamente la provetta e si agita 2-3 minuti, immergendo frequentemente il fondo della

provetta in b.m. bollente: la reazione è completa quando l'indicatore vira dal blu al giallo. Al

termine, si raffredda la provetta sotto acqua corrente, quindi si apre e si aggiungono 5 ml della

soluzione metanolica di acido cloridrico.

5.3.

Dopo agitazione per alcuni secondi, si pone la provetta in posizione inclinata quindi si imprimono



ad essa delle leggere scosse che facilitano l'affioramento degli esteri metilici sotto forma di massa

oleosa (Nota A).

Si prelevano gli esteri metilici mediante siringa, si introducono in una provetta a fondo conico, si

aggiunge un volume di allumina pari a circa 1/4 del volume degli esteri metilici, si agita e si filtra su

carta.

Nota A: Nel caso non si abbia separazione spontanea degli esteri metilici, aggiungere nella

provetta 5 ml di acqua ed agitare.
Procedimento E

2.


PRINCIPIO DEL METODO

La sostanza grassa in esame vienc riscaldata a ricadere con metanolo-esano-acido solforico. Gli

esteri metilici ottenuti sono estratti con etere di petrolio.

3.


APPARECCHIATURA

3.1.


Provetta da 20 ml circa, munita di refrigerante a ricadere ad aria, della lunghezza di 1 m circa, con

giunti a smeriglio.

3.2.

Pipetta tarata da 5 ml.



3.3.

Imbuto separatore da 50 ml.

3.4.

Cilindri graduati da 10 e 25 ml.



3.5.

Provetta da 15 ml, a fondo conico.

4.

REAGENTI


4.1.

Reagente di metilazione: metanolo anidro-esano-acido solforico concentrato (d 1,84) in raporto

75:25:1 (V/V/V).

4.2.


Etere di petrolio 40-60 oC.

4.3.


Sodio solfato anidro.

5.


PROCEDIMENTO

5.1.


Nella provetta da 20 ml si introduce il materiale recuperato dalla placca e si aggiungono 5 ml di

reagente di metilazione.

5.2.

Si collega il refrigerante a ricadere e si riscalda per 30 minuti in bagnomaria bollente (Nota 2).



5.3.

Si trasferisce quantitativamente la miscela in un imbuto separatore da 50 ml, aiutandosi con 10 ml

di acqua distillata e 10 ml di etere di petrolio. Si agita vigorosamente, si lasciano separare le fasi, si

allontana lo strato acquoso e si lava lo strato etereo per due volte con 20 ml di acqua distillata. Si

aggiunge nell'imbuto separatore una piccola quantità di solfato sodico anidro, si agita, si lascia a

riposo per qualche minuto e si filtra, raccogliendo il filtrato in una provetta a fondo conica da 15

ml.

Si evapora il solvente su bagnomaria, in corrente di azoto.



Nota 1: È possibile preparare facilmente in laboratorio piccole quantità d'acido cloridrico gassoso,

modificando la soluzione disponibile in commercio (r= 1,18) aggiungendo qualche goccia d'acido

solforico concentrato

(r= 1,84). Il gas liberato può facilmente essere seccato se viene fatto gorglogliare nell'acido

solforico concentrato. Poiché l'acido cloridrico è rapidamente assorbito dal metanolo, si

raccomanda di prender le precauzioni abituali al momento della dissoluzione, ad esempio

introducendo il gas con una piccola fiala rovesciata il cui bordo sfiora la superficie del liquido. La

soluzione metanolica d'acido cloridrico può essere preparata in anticipo in grandi quantità, poiché

si conserva perfettamente in bottiglie con tappo di vetro conservate nell'oscurità.

Nota 2: Per controllare l'ebollizione introdurre una bacchetta di vetro nella provetta e limitare la

temperatura del bagnomaria a 90 oC.
ALLEGATO XI

DETERMINAZIONE DEL TENORE DI SOLVENTI ALOGENATI VOLATILI NELL'OLIO

DI OLIVA 1.

PRINCIPIO

Analisi mediante cromatografia in fase gassosa secondo la tecnica dello spazio di testa (head

space).


2.

APPARECCHIATURA

2.1.

Apparecchio di cromatografia in fase gassosa, munito di rivelatore a cattura di elettroni.



2.2.

Apparecchiatura per spazio di testa.

2.3.

Colonna per cromatografia in fase gassosa, in vetro, di 2 m di lunghezza e 2 mm di diametro, fase



stazionaria.

OV101 al 10 % o equivalente, impregnato su una terra di diatomee calcinata, lavata con acidi e

silanizzata, di granulometria 80-100 Mesh.

2.4.


Gas vettore e gas ausiliario; azoto per cromatografia in fase gassosa, idoneo alla rivelazione per

cattura di elettroni.

2.5.

Bottiglie in vetro da 10 a 15 ml, munite di una guarnizione in teflon e di un tappo d'alluminio



provvisto di un orifizio per prelievo a mezzo siringa.

2.6.


Pinze a chiusura ermetica.

2.7.


Siringa per gas da 0,5 a 2 ml.

3.


REATTIVI

Solventi alogenati volatili di purezza idonea all'impiego per cromatografia in fase gassosa.

4.

PROCEDIMENTO



4.1.

Pesare con precisione 3 g d'olio circa in una bottiglia di vetro (da non riutilizzare) e chiudere la

bottiglia ermeticamente. Riporre la bottiglia in un termostato a 70 oC per un'ora. Prelevare con

precisione con la siringa un volume da 0,2 a 0,5 ml dallo spazio di testa ed iniettarlo nella colonna

del cromatografo in fase gassosa regolato come segue:

- temperatura dell'iniettore: 150 oC

- temperatura della colonna: 70-80 oC

- temperatura del rivelatore: 200-250 oC

Si possono usare temperature diverse purché i risultati siano equivalenti.

4.2.


Soluzioni di riferimento: preparare soluzioni standard, usando olio d'oliva, raffinato senza traccia di

solventi, a concentrazioni variabili tra 0,05 e 1 mg/kg ed in relazione con il tenore presunto del

campione. L'eventuale diluizione deve essere fatta con pentano.

4.3.


Valutazione quantitativa: fare il rapporto tra le superfici o le altezze dei picchi del campione e della

soluzione standard corrispondente alla concentrazione presunta più vicina. Se lo scarto relativo

supera il 10 % occorre ripetere l'analisi comparato con una nuova soluzione standard, fino a che la

sua concentrazione rientri nel suddetto scarto relativo. Il tenore è determinato in base ad una

media di iniezioni elementari.

4.4.


Espressione dei risultati: i risultati sono espressi in mg/kg (ppm). Il limite di rivelazione del metodo

è di 0,01 mg/kg.


ALLEGATO XII

VALUTAZIONE ORGANOLETTICA DELL'OLIO DI OLIVA VERGINE 1.

PREMESSA

Il presente metodo si propone di stabilire i criteri necessari alla valutazione delle caratteristiche del

flavor dell'olio di oliva vergine e di sviluppare l'opportuna metodologia.

2.


CAMPO DI APPLICAZIONE

Il metodo descritto è applicabile soltanto alla valutazione e alla classificazione organolettica

dell'olio di oliva vergine utilizzabile per il consumo diretto. Si limita a classificare l'olio vergine in

una scala numerica stabilita in rapporto alla percezione degli stimoli del suo flavor secondo il

giudizio di un gruppo di assaggiatori scelti costituiti in «panel».

3.


VOCABOLARIO GENERALE DI ANALISI SENSORIA

Vedi norma prevista nel capitolo «Analisi sensoria: vocabolario generale».

4.

VOCABOLARIO SPECIFICO PER L'OLIO D'OLIVA



Acqua di vegetazione: flavor caratteristico acquisito dall'olio a causa di cattiva decantazione e

prolungato contatto con le acque di vegetazione.

Amaro: sapore caratteristico dell'olio ottenuto da olive verdi o invaiate. Può essere più o meno

gradevole, secondo l'intensità.

Aspro: sensazione caratteristica di alcuni oli che, all'assaggio, producono una reazione orale-tattile

di astringenza.

Avvinato-inacetito: flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda quello del vino o dell'aceto. È

dovuto fondamentalmente alla formazione di acido acetico, acetato di etile e etanolo, in quantità

superiori alle normali nell'aroma dell'olio d'oliva.

Cetriolo: flavor che si produce nell'olio durante un imbottigliamento ermetico eccessivamente

prolungato, particolarmente in lattine, che è attribuito alla formazione di 2-6 nonadienale.

Cotto o stracotto: flavor caratteristico dell'olio dovuto a un eccessivo e/o prolungato riscaldamento

durante l'ottenimento, specialmente durante la termo-impastatura, se avviene in condizioni inadatte.
Dolce: sapore gradevole dell'olio nel quale, senza essere esattamente zuccherino, non primeggiano

gli attributi amaro, astringente e piccante.

Erba: flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda l'erba appena tagliata.

Fecce: flavor caratteristico dell'olio ricuperato dai fanghi decantati in depositi e torchi.

Fieno: flavor caratteristico di alcuni oli che ricorda l'erba più o meno secca.

Fiscolo: flavor dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli sporchi di residui fermentati.

Foglie verdi (amaro): flavor dell'olio ottenuto da olive eccessivamente verdi o che siano state

macinate con foglie e rametti.

Fruttato: flavor che ricorda l'odore e il gusto del frutto sano, fresco e colto al punto ottimale di

maturazione.

Fruttato maturo: flavor dell'olio d'oliva ottenuto da frutti maturi generalmente di odore smorzato e

sapore dolciastro.

Grasso di macchina: odore dell'olio d'oliva ottenuto in frantoio dal cui macchinario non sono stati

adeguatamente eliminati resti di petrolio, di grasso o di olio minerale.

Grossolano: percezione caratteristica di alcuni oli che, all'assaggio, producono una sensazione

orale-tattile densa e pastosa.

Mandorlato: questo flavor può manifestarsi in due modi: quello tipico della mandorla fresca, o

quello proprio della mandorla secca e sana che si può confondere con un rancido incipiente. Si

apprezza come un retrogusto quando l'olio resta in contatto con la lingua e il palato. Si associa agli

oli dolci e di odore smorzato.

Mela: flavor dell'olio di oliva che ricorda questo frutto.

Metallico: flavor che ricorda il metallo. È caratteristico dell'olio mantenuto a lungo in contatto con

alimenti o superficie metalliche, in condizioni inadatte, durante i procedimenti di macinatura,

impastatura, pressione o ammasso.

Muffa-umidità: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da frutti nei quali si sono sviluppati abbondanti

funghi e lieviti per essere rimasti ammassati molti giorni, in ambienti umidi.

Rancido: flavor caratteristico e comune a tutti gli oli e grassi che hanno sofferto un processo

autossidativo, a causa del loro prolungato contatto con l'aria. Questo flavor è sgradevole e

irreversibile.

Riscaldo: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive ammassate che hanno sofferto un avanzato

grado di fermentazione.

Salamoia: flavor dell'olio estratto da olive conservate in soluzioni saline.

Sansa: flavor caratteristico che ricorda quello della sansa di oliva.

Saponoso: flavor con una sensazione olfatto-gustativa che ricorda quella del sapone verde.

Smorzato o piano: flavor dell'olio d'oliva dalle caratteristiche organolettiche molto tenui, a causa

della perdita dei componenti aromatici.

Sparto: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive pressate in fiscoli nuovi di sparto. Il flavor

può essere differente se il fiscolo è fatto con sparto verde o con sparto secco.

Terra: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive raccolte con terra o infangate e non lavate. In

qualche caso questo flavor può manifestarsi insieme con quello della muffa-umidità.

Vecchio: flavor caratteristico dell'olio quando resta troppo tempo in recipienti di ammasso. Può

darsi anche in oli imbottigliati per un periodo eccessivamente lungo.

Verme: flavor caratteristico dell'olio ottenuto da olive fortemente colpite da larve di mosca

dell'olivo (dacus oleae).

5.

BICCHIERE PER L'ASSAGGIO DI OLI



Vedi capitolo «Bicchiere per l'assaggio di oli».

6.


SALA DI ASSAGGIO

Vedi capitolo «Guida per l'allestimento di una sala di assaggio».

7.

UTENSILI


In ogni cabina e a disposizione dell'assaggiatore devono esserci gli utensili necessari perché questi

possa esercitare adeguatamente il suo lavoro. Sono:

- bicchieri (normalizzati), contenenti i campioni contrassegnati in chiave con numeri a due cifre

presi a caso, o con un paio di numeri e lettere. Le indicazioni devono farsi con una matita

indelebile e inodora,

- vetri di orologio recanti le stesse indicazioni, per coprire i bicchieri,

- foglio di punteggio, vedi fig. 2, con le istruzioni per l'uso,

- matita o penna a sfera,

- piattini con fettine di mela,

- bicchiere d'acqua a temperatura ambiente.

8.

METODOLOGIA



In questo comma si stabiliscono le cognizioni previe necessarie per la realizzazione dell'analisi

sensoria degli oli di oliva vergini e si cerca di normalizzare il comportamento e il modo di

procedere degli assaggiatori che devono intervenire nella prova, i quali devono prendere coscienza

tanto delle raccomandazioni di tipo generale, quanto di quelle specifiche per l'assaggio degli oli di

oliva.

8.1.


Ruolo dell'organizzatore o capo del panel (o gruppo di assaggiatori)

L'organizzatore del panel dovrà essere una persona sufficientemente formata, intenditrice ed

esperta nei tipi di olio che troverà nel suo lavoro. È la figura chiave del panel e il responsabile della

sua organizzazione e del suo funzionamento. Convocherà gli assaggiatori con tempo sufficiente e

chiarirà loro qualsiasi dubbio sulla realizzazione delle prove, pur astenendosi di suggerire qualsiasi

opinione sul campione.

Sarà responsabile dell'inventario degli utensili, della loro pulizia, della preparazione e codificazione

dei campioni, nonché della loro presentazione agli assaggiatori secondo il disegno sperimentale

adottato, del compendio dei dati e del loro trattamento statistico, per ottenere i migliori risultati col

minore sforzo.

Il lavoro del capo del panel richiede abilità sensoria, meticolosità nella preparazione delle prove,

ordine rigoroso di esecuzione, nonché abilità e pazienza per pianificare ed eseguire le prove.

Missione del capo del panel è lo stimolare il morale dei componenti del gruppo, suscitando tra loro

l'interesse, la curiosità e lo spirito di emulazione. Deve evitare che si conosca la sua opinione e

impedire che i criteri di possibili leader si impongano sugli altri assaggiatori. Spetta anche a lui

allenarli, sceglierli e controllarli, per sapere se si mantengono con il livello di attitudine adeguato.

8.2.

Condizioni dell'assaggio



8.2.1.

Dimensioni del campione

La quantità di olio contenuto in ciascun bicchiere deve essere di 15 ml.

8.2.2.


Temperatura della prova

I campioni di olio da assaggiare si manterranno nei bicchieri a 28 oC p2 oC. È stata scelta questa

temperatura per essere quella alla quale si osservano più facilmente differenze organolettiche, in

temperatura normale, quando gli oli si usano come condimento. Un'altra ragione che spinge a

prendere questo valore è che temperature più basse o più alte producono una scarsa

volatilizzazione dei componenti aromatici o, al contrario, la produzione dei volatili propri degli oli

riscaldati.

8.2.3.


Orario della prova

Per l'assaggio di oli, le ore di lavoro ottimali sono quelle di mattina. È dimostrato che durante la

giornata vi sono periodi di percezione ottimale per il gusto e l'olfatto.

I pasti sono preceduti da un periodo d'incremento della sensibilità olfatto-gustativa, e seguiti da

una diminuzione.

Tuttavia questo criterio non deve esagerarsi fino al punto che la fame possa distrarre gli

assaggiatori, riducendo la loro capacità di discriminazione e, particolarmente, i loro criteri di

preferenza e accettazione.

9.

ASSAGGIATORI



Le persone che intervengono come assaggiatori nelle prove organolettiche di oli di oliva

commestibili dovranno essere preparati e scelti secondo la loro abilità a distinguere tra campioni

similari; tengasi conto che la precisione migliorerà con l'allenamento (vedi comma corrispondente).

Per la prova occorrono da 8 a 12 assaggiatori. Conviene disporre di qualcuno di piú, di riserva,

per sopperire a possibili assenze.

9.1.


Norme generali di comportamento per candidati e assaggiatori

Le presenti raccomandazioni si riferiscono al comportamento dei candidati e degli assaggiatori

durante il loro lavoro.

Al ricevere la comunicazione del capo del panel, per intervenire in una prova organolettica,

l'assaggiatore dovrà essere in condizioni di realizzarla all'ora previamente indicata, attenendosi a

quanto segue:

9.1.1.

Si asterrà dal fumare almeno 30 minuti prima dell'ora fissata.

9.1.2.

Non userà nessun profumo, cosmetico o sapone il cui odore persista al momento della prova. Per

lavarsi le mani si servirà di un sapone non profumato o poco profumato e se le sciacquerà e

asciugherà tutte le volte che sia necessario per eliminare qualsiasi odore.

9.1.3.

Non dovrà aver preso nessun alimento almeno un'ora prima dell'assaggio.

9.1.4.

Se si trovasse in condizioni di inferiorità fisiologica, particolarmente se ha il senso dell'olfatto o del

gusto alterato, o se è sotto qualche effetto psicologico che gli impedisca di concentrarsi nel suo

lavoro, dovrà comunicarlo al capo del panel, o perché lo esenti dal lavoro, o perché prenda le

decisioni opportune, tenendo conto del possibile scostamento dai valori medi del resto del panel.

9.1.5.


L'assaggiatore, verificate le norme precedenti, occuperà il suo posto nella cabina assegnatagli,

nella maniera più ordinata e silenziosa possibile.

9.1.6.

Una volta seduto, controllerà se il materiale che gli occorre è in ordine e quello giusto e se la

chiave del bicchiere corrisponde con quella del vetro di orologio che la copre.

9.1.7.


Leggerà con attenzione le istruzioni contenute nel foglio di punteggio, e non inizierà l'esame del

campione finché non sia totalmente compenetrato con il lavoro che deve realizzare. In caso di

dubbio, si consulterà in privato con il capo del panel.

9.1.8.


L'assaggiatore prenderà il bicchiere tenendolo coperto col vetro di orologio e l'inclinerà

leggermente e in questa posizione lo girerà completamente per bagnare il più possibile la superficie

interna. Fatto ciò, separerà il vetro d'orologio e odorerà il campione, facendo inspirazioni soavi,

lente e intense, fino a formarsi un criterio sull'olio che deve giudicare. Il periodo di odorazione non

deve eccedere i 30 secondi. Se in questo periodo non si è giunti a nessuna conclusione, si riposi

prima di un nuovo tentativo. Fatta la prova olfattiva, si giudicherà il flavour (sensazione congiunta

olfatto-gustativa-tattile). Si prenderà un sorsetto d'olio, di piú o meno tre ml. Importa molto

ripartire l'olio per tutta la cavità orale, dalla parte anteriore e dalla lingua, per i laterali e la parte

posteriore, fino ai pilastri del palato, giacché, come si sa, la percezione dei quattro sapori

fondamentali (dolce, salato, acido e amaro) varia d'intensità secondo le zone della lingua e del

palato.

Si deve insistere sulla necessità che l'olio si stenda in quantità sufficiente e molto lentamente dalla

parte posteriore della lingua verso i pilastri del palato e la gola, concentrando l'attenzione

nell'ordine di apparizione degli stimoli amaro e piccante; se non si facesse così, in alcuni oli di due

stimoli potrebbero passare inavvertiti o l'amaro essere occultato dal piccante.

Aspirazioni corte e successive, introducendo aria per la bocca, permettono, oltre ad estendere il

campione ampiamente per la cavità orale, di percepire per via retronasale i componenti volatili

aromatici.

Deve tenersi conto anche della sensazione tattile: devesi, perciò, prendere nota, se si notano

fluidità, pastosità, prurigine o bruciore, e se la prova lo richiede, quantificarne l'intensità.

9.1.9.

La valutazione organolettica di un olio vergine deve farsi per un solo campione per seduta, per

evitare l'effetto di contrasto che potrebbe produrre l'assaggio immediato di altri.

Dato che i successivi assaggi sono alterati dalla fatica, o perdita di sensibilità dovute ai precedenti,

sarà necessario servirsi di un prodotto capace di eliminare dalla bocca i resti d'olio dell'assaggio

anteriore.

Si raccomanda l'uso di un pezzettino di mela, di circa 15 gr, che, una volta masticato, può essere

sputato; sciacquarsi poi con un poco d'acqua a temperatura ambiente. Tra un assaggio e l'altro

devono passare almeno 15 minuti.

9.2.


Scelta di candidati

L'organizzatore del panel dovrà realizzare questa fase mediante interviste personali per conoscere

la personalità del candidato e le sue caratteristiche. I requisiti previ quanto alle condizioni

fisiologiche e psicologiche sono molto rigorosi, giacché, in principio, qualsiasi persona normale può

svolgere questa attività. L'importanza dell'età, del sesso, di certe abitudini (fumare), ecc. si

considerano secondarie dinanzi ad altri aspetti come: la salute, l'interesse personale e il tempo

disponibile.

Durante l'intervista, l'organizzatore della prova deve spiegare al candidato le caratteristiche

dell'attività che realizzerà e informarlo sul tempo approssimativo che dovrà dedicarle. Deve poi

raccogliere dati che gli permettano di valutare il grado di interesse e la motivazione del candidato,

nonché della sua disponibilità reale di tempo. Dovrà servirgli di riferimento il seguente questionario.
.
QUESTIONARIO

Per favore, risponda adesso alle seguenti domande:

q q

1)

Le piacerebbe collaborare a questi lavori?



q

no



q

2)

Considera che il lavoro può essere importante per migliorare la qualità degli alimenti nel suo paese



e nel commercio internazionale?

q



no

q

3)



Perché? (¹) .

.

.



.

4)

Non dimentichi che in questo lavoro dovrà provare degli oli quando le sarà chiesto. Le dispiace



farlo?

q



no

q

5)



Le piacerebbe confrontare la sua abilità olfatto-gustativa con quella dei suoi compagni?

q



no

q

6)



Ha tempo disponibile? Ha sufficiente indipendenza per organizzare il suo lavoro quotidiano?

q



no

q

7)



Se dipende da un capo, crede che se in giorni successivi l'allontanassero più volte, in certi casi fino

a mezz'ora, dal suo lavoro abituale le sarebbe possibile partecipare a questo compito?

q

no



q

8)

Sarebbe disposto a ricuperare il tempo che dedicherebbe all'analisi sensoria percompensare il suo



lavoro ordinario?

q



no

q

9)



Considera che questo lavoro dovrebbe essere retribuito?

q



no

q

10)



Come?

.
Con questa informazione l'organizzatore realizzerà la scelta preliminare, rifiutando i candidati con

poco interesse per questo tipo di lavoro, con poco tempo disponibile o incapaci di concretare le

loro idee.

(¹) Descriva l'interesse che può avere la valutazione organolettica di qualsiasi alimento o, se vuole,

dell'olio di oliva.

9.3.

Determinazione della «soglia media» del gruppo per «attributi caratteristici»



Si scelgono con cura quattro oli, in maniera che ciascuno sia considerato come rappresentante

tipico degli attributi: Riscaldo, Avvinato, Rancido e Amaro, con la maggiore e più chiara intensità

possibile.

Prendendo un'aliquota di ciascuno si preparano campioni, a differenti concentrazioni per

successive diluzioni (ragione 2) con il supporto oleoso adeguato finché nelle due o tre ultime

diluzioni non sia possibile scoprire differenza con il bicchiere che contiene soltanto il supporto.

Un'ultima coppia la formeranno due bicchieri di supporto oleoso.

La serie si completerà con bicchieri di concentrazioni superiori, fino a un totale di otto.

Preparare una quantità sufficiente di campioni delle differenti concentrazioni per dare serie

complete di ciascun attributo a ciascuno dei candidati.

Per stabilire la «soglia media» dei candidati per ciascun attributo si presenterà loro un bicchiere

con 15 ml di una qualsiasi delle concentrazioni preparate, insieme con un altro bicchiere con 15 ml

del solo supporto. Il candidato, fatta la prova, deve indicare se sono uguali o diverse.

La stessa prova si ripete per le altre concentrazioni dell'attributo studiato.

Si annota il numero di risposte corrette ottenute per ciascuna concentrazione dal complesso di

candidati e si riferisce come percento del numero di prove eseguite.

Si rappresenta in ordine crescente, nelle ascisse le concentrazioni provate e nelle ordinate il

percento di identificazioni corrette fatte per ciascuna concentrazione.

La figura 1 rappresenta un esempio pratico di quanto anteriormente esposto. La soglia di

rivelazione si definisce sulle ascisse extrapolando dalla curva il punto dell'ordinata che corrisponde

a un 75 % di prove riuscite.

Questa concentrazione «soglia» può essere distinta per ciascun olio di un lotto, e dipende

dall'intensità dell'attributo in detto olio; deve essere similare per i distinti gruppi di candidati di

distinti «panels»; non è vincolata a nessuna abitudine, consuetudine o preferenza tendenziale; è,

perciò, un punto di riferimento comune a qualsiasi gruppo umano normale e può servire per

rendere omogenei i distinti «panels» soltanto per la loro sensibilità olfatto-gustativa.

Partendo dalla concentrazione soglia del gruppo ottenuta:

Si prepara una serie di concentrazioni crescenti e decrescenti in maniera che questa

«concentrazione soglia» corrisponda al posto 10 di questa scala. Logicamente le concentrazioni 11

e 12 saranno più diluite e pertanto sarà molto difficile scoprirvi l'esistenza dell'olio con l'attributo

scelto.

Dalla concentrazione C10, gli altri campioni possono prepararsi mediante la formula:

C10 x an, ove «a» è una costante corrispondente al fattore di diluzione uguale a 1,5 e «n»

l'esponente che varierà da 9 a -2.

Per esempio: posta la soglia ottenuta per l'olio rancido = 0,32, sarà C10 = 0,32 e dato che a =

1,5 la serie di campioni avrà le seguenti concentrazioni:

Campioni

1

2



3

4

5



6

7

8



9

10

11



12

Concentrazione

12,30

8,20


5,47

3,65


2,43

1,62


1,08

0,72


0,48

0,32


0,21

0,14
Se si ripete quanto detto per gli altri tre attributi, partendo dalle soglie rispettive calcolate anche

come è stato indicato, si otteranno scale che per tutti i laboratori avranno intensità aromatiche

similari per ciascuno stimolo, sebbene si sia partiti da oli di oliva i cui difetti sono percettibili con

distinta intensità.

9.4.


Scelta di assaggiatori col metodo di «classificazione di intensità»

La scelta deve farsi partendo da un numero di candidati due o tre volte superiore a quello

necessario per formare il gruppo, per poter scegliere i più sensibili e quelli con maggior capacità

discriminatrice. È sempre consigliabile fare le prove con lo stesso prodotto che si analizzerà poi.

(Pertanto, noi impiegheremo olio di oliva).

Nella scelta del metodo, insieme con la sua efficacia non si deve dimenticare che interessa che la

procedura da seguire sia la più economica possibile quanto a quantità di olio, numero di campioni

da impiegare e tempo dedicato alla scelta. L'efficacia di una procedura di scelta è caratterizzata

dalla scelta dei livelli ottimali delle tre seguenti variabili dipendenti: a) «costo» determinato dal

numero di prove, b) «proporzione» di candidati potenzialmente adatti, che per caso possono

essere sfortunatamente rifiutati nella cernita e c) «proporzione» di candidati non adatti che per un

caso favorevole sono accettati nella scelta pur non dovendo.

La procedura di selezione, scelta e proposta, è quella della «prova di classificazione d'intensità»

(The intensity rating test) descritta nelle norme ASTM*, STP* n. 440, pag. 53, modificata in

quattro punti:

1) riduzione del numero di campioni nella serie,

2) ampliamento di stimoli, per aumentare il numero di note olfatto-gustative sulle quali è fondata la

selezione, per adattarle ai difetti più comuni percettibili nell'olio di oliva,

3) variazione della relazione di concentrazione nella serie, e

4) trattamento statistico dei risultati.

Materiale necessario

- bottiglie o matracci di 1 500 ml,

- bicchieri di vetro scuro,

- provette di 10 ml, 15 ml, 1 000 ml e 1 500 ml.

Prodotti necessari

- paraffina Merck (riferimento 7.160, DAB 8, USP XX) o supporto oleoso inodoro e insipido

(olio di oliva o un altro similare) raffinato di recente),

- oli: riscaldo, avvinato, rancido e amaro.

* American Society for Testing and Materials (ASTM), Special Technical Publication (STP).

9.4.1.


Modo di operare

Preparate le concentrazioni, si comincerà la selezione partendo da 25 candidati, secondo la

seguente metodologia per ciascuno stimolo:

1) Si preparano serie di dodici bicchieri, marcati con chiave di identificazione (una serie per

candidato). In ciascun bicchiere si versano 15 ml di ciascuna delle distinte concentrazioni,

preparate secondo la formula C10 x an.

2) Conviene che i bicchieri, pieni, rimangano nella sala di assaggio, a 20-22 oC, coperti con un

vetro di orologio almeno un'ora prima delle prove perché raggiungano la temperatura ambiente.

3) L'organizzatore della prova ordinerà i dodici bicchieri di una serie in fila da maggiore a minore

concentrazione.

Si invita, quindi, ciascun candidato a fare la prova, separatamente, dandogli le seguenti istruzioni:

9.4.2.


Istruzioni per il candidato

I dodici bicchieri allineati dinanzi al candidato contengono diluzioni di ciascuno degli stimoli

riscaldo, avvinato, rancido o amaro, secondo il caso. I bicchieri differiscono gli uni dagli altri

nell'intensità dell'odore; quello di odore più intenso trovasi nell'estrema sinistra, l'intensità di odore

dei restanti diminuisce gradualmente verso destra. L'ultimo bicchiere a destra può avere così poco

odore che potrebbe essere impossibile rivelarlo.

Procedere così: si abitui agli odori dei bicchieri della serie. Cominci, perciò, con quello a destra (n.

12) e cerchi di ricordare l'intensità degli odori. Non si stanchi.

Quando consideri che ha preso familiarità con la scala di concentrazione di odore presentata, esca

dalla sala.

Frattanto, l'organizzatore sceglierà un bicchiere dalla serie che accoppierà con l'ultimo della destra

e coprirà il vuoto avvicinando tra loro i restanti. Ritorni quindi in sala e continui la prova.

La prova è la seguente.

Riponga il bicchiere separato al posto giusto della serie. Per far ciò, può odorarlo e confrontarlo

con gli altri tante volte quante vuole; se lo rimette al posto giusto, deve odorare più forte del più

vicino di destra e meno di quello della sinistra. Questa prova dovrà ripeterla con altri tre bicchieri.

.
Per agevolare l'operazione e la raccolta della risposta data, a ciascun candidato si consegnerà,

insieme con le istruzioni già descritte, il seguente specchietto:

SCELTA DI CANDIDATI

Prova n. .

Attributo .

Il bicchiere problema corrisponde al posto n. .


Data .

Nome .
9.4.3.

Ottenimento dei risultati

Per facilitare l'ordinamento dei dati di ciascun candidato, l'organizzatore del «panel», li annoterà

nella seguente forma:

Nome del


candidato

Attributo

studiato

N. di ordine

dato (Kí)

N. di ordine che

gli spetta (K)

Punteggio

(Kí-K)²

.

.



.

.

.



.

.

.



.

.
9.4.4.

Procedimento statistico di punteggio

Nel caso concreto della selezione richiesta, i bicchieri da reintegrare al loro posto dovranno essere

gli stessi per tutti e per ciascun candidato e secondo i calcoli statistici realizzati per questo caso,

saranno quelli il cui ordine di serie è qui indicato per ciascun attributo.

Riscaldo (Ri)

Avvinato (Av)

Rancido (Ra)

Amaro (Am)

Bicchiere n.

Bicchiere n.

Bicchiere n.

Bicchiere n.

(10, 5, 7, 2)

(11, 3, 8, 6)

(7, 4, 10, 2)

(6, 3, 11, 9)


Il numero occupato dai bicchieri nella serie non può essere variato, giacché i calcoli statistici per

questa prova sono stati fatti conformemente alla probabilità che i bicchieri siano rimessi al loro

posto per caso.

Orbene, per impedire qualsiasi passaggio d'informazione da un candidato all'altro, l'organizzatore

del «panel» terrà presente i seguenti punti:

1) I candidati non possono comunicare tra loro. Le chiavi saranno differenti per ciascun candidato.


2) I candidati non devono conoscere la posizione dei bicchieri loro tolti.

3) Sebbene tutti i candidati debbano ricevere i bicchieri prima indicati, l'organizzatore deve

variarne l'ordine di consegna.

A ciascun candidato si assegna un punteggio, in funzione dei risultati ottenuti, nella seguente

maniera:

Siano ei1, ei2, ... ei12 i dodici bicchieri con le dodici concentrazioni corrispondenti di un attributo i

(i = uno qualsiasi dei quattro attributi riscaldo, avvinato, rancido e amaro) ordinate da maggiore a

minore.


Sia eik uno dei bicchieri scelti e sia Kí la posizione assegnatagli dal candidato nella serie. I valori di

K e Kí sono, perciò, numeri interi compresi tra l'1 e il 12, che corrispondono alla posizione reale e

a quella assegnata dal candidato, rispettivamente.

Sia T (massimo scostamento ammesso) un valore, prefissato, nel nostro caso uguale a 3 in maniera

che se (Kí-K) > T il candidato è scartato automaticamente (1).

Se invece (Kí-K) § T, il candidato in principio, non è scartato e può continuare la prova, dato che

è capace di situare lo stimolo problema nel posto giusto o almeno nei posti più prossimi.

In tal caso, il punteggio assegnato a un candidato, quando valuta uno stimolo (concentrazione) di

un tipo determinato, per es. della serie riscaldo (Ri), sarà pari al quadrato della differenza tra il

numero di ordine che spetta alla posizione corretta che occuperebbe nella serie il bicchiere

contenente lo stimolo e la posizione nella quale il candidato lo ha rimesso. Ossia:

Ph(Ri) = (Kí-K)2

Dato che questa operazione sarà realizzata da uno stesso candidato su quattro stimoli

(concentrazioni) di ciascun attributo, il punteggio parziale per dotto tipo (per es.: Ri) sarebbe:

ZRi = PRih + PRij + PRil + PRim

Per maggior chiarezza si espongono gli esempi seguenti:

Esempio 1:

Supponiamo che le risposte del candidato A per i quattro stimoli ritirati dalla serie dell'attributo (i)

siano:

Posizione corretta del bicchiere

nella serie

(K)
Posizione nella quale fu messo

(Kí)

Scostamento dalla



posizione corretta

(Kí-K)


7

7

7-7 = -0



4

5

4-5 = -1



10

6

10-6 = -4 (¹)



2

4

2-4 = -2


(2) Questo candidato è eliminato, giacché ha ottenuto nella prova un valore di T > 3.

Esempio 2:

Supponiamo che un candidato riordini così i bicchieri di un attributo:

Posizione corretta del bicchiere

nella serie

(K)
Posizione nella quale fu messo

(Kí)

Scostamento dalla



posizione corretta

(Kí-K)


7

7

7-7 = -0



4

4

4-4 = -0



10

7

10-7 = -3



2

3

2-3 = -1


Questo candidato non è eliminato e il punteggio che ottiene per questo attributo è:

Zi = 02 + 02 + 32 + (-1)2 = 10

Il punteggio finale del candidato che ci permetterà di sceglierlo o no come assaggiatore in funzione

delle sue risposte dinanzi ai quattro tipi che abbiamo preso per la scelta sarebbe:

PAm + PAm + PAm + PAmm = Z finale = ZCh + ..... + ZAm

PRhi


+ PRji

+ PRli


+ PRmi

= ZRi


PAhv

+ PAjv


+ PAlv

+ PAmv


= ZAv

PRha


+ PRja

+ PRla


+ PRma

= ZRa


PAhm

+ PAjm


+ PAlm

+ PAmm


= ZAm

= Z finale = Zri + ..... + ZAm

dove: Am

dove:


Ri

= Riscaldo

Av

= Avvinato



Ra

= Rancido

Am

= Amaro
Si tratta adesso di determinare fino a quale valore di Z si può considerare che il candidato



possiede buoni livelli di percezione, memoria olfattiva e organizzazione mentale per dare l'adeguata

risposta per i quattro stimoli dati. Naturalmente Z è sempre un valore non negativo, e Z = 0

significa che il candidato ha riconosciuto e quantificato correttamente tutte le sedici intensità

presentategli (quattro di ciascun attributo). Valori di Z diversi da zero indicano che il candidato ha

riconosciuto le zone delle scale dove si situano le intensità scelte, ma all'interno d'esse, non ha

potuto assegnare correttamente una posizione per non possedere una buona capacità

discriminatrice associata alla scala d'intensità presentatagli per uno o vari stimoli.

Cosicché, si dovrà determinare un valore critico Z, tale che, nell'ipotesi in cui il candidato assegni

tutte le posizioni nella scala a caso, all'interno delle zone che previamente ha riconosciuto, la

probabilità di un punteggio definitivo Z, inferiore a Zc, sia una quantità sufficientemente piccola á

che si può fissare previamente. In altre parole: che la probabilità che con questa procedura si

scelga un assaggiatore per il «panel», che non possegga sufficiente capacità discriminatrice per le

intensità degli stimoli impiegati per la scelta, sia inferiore a á.

Fissato á, nel nostro caso uguale a 0,05, l'ottenimento di Zc dipende dalla distribuzione di

probabilità della variabile Z, che, a sua volta, dipende dalle distribuzioni di probabilità delle

variabili p(Kí).

Fatti gli appositi calcoli statistici il valore ottenuto per Zc è uguale a 34.

Ottenuto il punteggio Z di tutti i candidati, saranno eliminati quelli dal punteggio superiore a 34.

Per esempio, i candidati A e B ottengono i seguenti punteggi:
ZAm = 34 ZAm = 34

Tipo


Candidato A

Candidato B

Riscaldo

ZRi


= 10

PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 391R2568.2ZRi

= 12

Avvinato


ZAv

= 10


ZAv

= 11


Rancido

ZRa


= 10

ZRa


= 15

Amaro


ZAm

= 4


ZAm

= 0


Ó

= 34


Ó

= 38
I valori di Z per i due candidati sono: 34 per l'A e 38 per il B; quindi sarà eletto il candidato A e

scartato il B. Eliminati i candidati con punteggio superiore a 34, i restanti si ordineranno per i loro

valori di Z, scegliendosi per ordine fino a completare i dodici che desideriamo riunire.

(3) Cancellare quanto non serva.

(4) Percezione:

0 = (5)

1 = Appena percettibile

2 = Leggera

3 = Media

4 = Grande

5 = Extrema


Tabella di punteggio

Difetti


Caratteristiche

Valutazione

totale: punti

Nessuno


Fruttato di oliva

Fruttato di oliva e

altra frutta fresca

9

8



7

Lievi e appena

percettibili

Fruttato tenue di

qualsiasi tipo

6

Percettibili



Fruttato un po'

difettoso, odori e

sapori anomali

5

Notevoli, nel limite dell' accettabilità



Chiaramente difettoso, odori e sapori

agradevoli

4

Grandi e/o gravi



chiaramente

percettibili

Odori e sapori

totalmente

inammissibili

per il consumo

3

2

1



.
Osservazioni: .

.

Nome dell'assaggiatore: .



.

Chiave del campione: .

Data: .

ANALISI SENSORIA: VOCABOLARIO GENERALE 1.

PREMESSA

La presente norma si propone di riunire i concetti generali utilizzati per l'analisi sensoria dell'olio

d'oliva e di darne la definizione.

2.


VOCABOLARIO

2.1.


Terminologia generale

Analisi sensoria (sostantivo):

Esame dei caratteri organolettici di un prodotto mediante i sensi.

Percezione (sostantivo):

Presa di coscienza sensoria di oggetti o avvenimenti esterni.

Organolettico (aggettivo) (carattere o proprietà):

Qualifica ogni proprietà di un prodotto suscettibile di essere percepita dagli organi dei sensi.

Esperto (sostantivo):

(Per ciò che concerne l'esame dei caratteri organolettici)

Assaggiatore specializzato nell'analisi sensoria di un determinato prodotto e che possiede

cognizioni fondamentali sulla sua elaborazione e sulle preferenze del mercato.

Assaggiatore (sostantivo):

Persona perspicace, sensibile, scelta e allenata, che stima con gli organi dei suoi sensi i caratteri

organolettici di un alimento.

Gruppo di assaggiatori:

Insieme di assaggiatori che si riuniscono per eseguire, in condizioni controllate, l'analisi sensoria del

prodotto.

Sensazione (sostantivo):

fenomeno soggettivo risultante dallo stimolo di un sistema sensorio. Questo fenomeno è

soggettivamente discriminabile e oggettivamente definibile attraverso l'organo sensorio interessato,

secondo la natura o la qualità dello stimolo, nonché la sua intensità.

Sensibilità (sostantivo):

capacità degli organi sensori di percepire qualitativamente e quantitativamente uno stimolo di poca

intensità o piccole differenze tra stimoli.

Assaggio (sostantivo):

operazione consistente in percepire, analizzare e giudicare i caratteri organolettici e più

particolarmente gli olfatto-gustativi, tattili e chinestetici di un prodotto alimentare.

Accettazione (sostantivo):

atto consistente in accogliere favorevolmente un prodotto da parte di un individuo o una

popolazione.

Armonia (sostantivo):

qualità di un prodotto che dà origine a una sensazione d'insieme gradevole. Detta sensazione è

dovuta alla percezione dei suoi componenti, che agiscono come stimoli olfatto-gustativi, tattili e

chinestetici per trovarsi in rapporti di concentrazione adeguati.

Accettabilità (sostantivo):

stato di un prodotto accolto favorevolmente da un individuo o da una popolazione, in funzione

delle sue proprietà organolettiche.

Discriminazione (sostantivo):

differenziazione qualitativa e/o quantitativa tra due o parecchi stimoli.

Compensazione (sostantivo):

risultato dell'interazione dovuta a un complesso di stimoli in modo che ciascuno si percepisca con

minore intensità che se agisse da solo.

Aspetto (sostantivo):

complesso di caratteri organolettici percepiti dall'organo della vista: dimensioni, forma, colore,

conformazione, torbidità, pulizia, fluidità, spuma e effervescenza. Questo termine è preferibile a

quello di apparenza.

Attributo (sostantivo):

proprietà caratteristica percettibile.

2.2.

Terminologia relativa alla fisiologia



Stimolo (sostantivo):

agente fisico o chimico che produce specificamente la risposta dei ricettori sensori esterni o interni.


Gusto (sostantivo):

uno dei sensi i cui ricettori sono localizzati nella bocca, particolarmente sulla lingua, e che sono

attivati da differenti composti in soluzione.

Gustativo (aggettivo):

qualifica la proprietà di un prodotto capace di stimolare l'apparato gustativo destando le sensazioni

corrispondenti a uno o più dei quattro sapori elementari: dolce, salato, acido e amaro.

Ricettore (sostantivo):

struttura specializzata di un organo sensorio eccitabile, capace di ricevere uno stimolo e convertirlo

in flusso nervoso.

Nota: i ricettori si classificano secondo il tipo di energia associata allo stimolo (luce, calore, suono,

ecc.).

Odorazione (sostantivo):

funzione dell'organo olfattivo tendente a percepire e distinguere le molecole che vi accedono, in

fase gassosa da un mezzo esterno, per via nasale diretta o indiretta.

Intensità (sostantivo):

grado di energia di una qualità misurabile secondo una scala quantitativa di valori superiori alla

soglia.

Adattamento (sostantivo):

modificazione temporale della sensibilità a percepire stimoli sensori come risultato di una continua

e ripetuta esposizione a questo o similare stimolo.

Inibizione (sostantivo):

mancanza di risposta da parte di un organo sensorio o di una sua parte, nonostante sia sottoposto

all'azione di uno stimolo adeguato di intensità superiore alla soglia.

Risposta (sostantivo):

azione con la quale le cellule sensorie rispondono a quella di uno o vari stimoli relativi a una

modalità sensoria definita.

Corpo (sostantivo):

sensazione tattile percepita nella bocca e che dà un grado di densità, viscosità, consistenza o

compattezza a un prodotto.

Fragranza (sostantivo):

odore fresco, soave e delizioso.

Odorare (verbo):

senso attivo applicato all'odorato.

Designa l'azione di percepire un odore.

Oggettivo (aggettivo):

a) qualifica ciò che dà una rappresentazione reale e comprovabile dell'oggetto, riducendo al

minimo i fattori umani (per es.: preferenza, abitudine, affettività);

b) qualifica quella tecnica che, impiegando o metodi sensori o metodi strumentali, permette di

ridurre al minimo gli errori peculiari.

Nota: Si consiglia di non impiegare come sinonimo il termine «strumentale».

Soggettivo (aggettivo):

Qualifica ciò che dà una percezione condizionata dal nostro modo di pensare o sentire e non

soltanto dallo stimolo.

Chinestesia:

complesso di sensazioni risultanti dall'applicazione di una pressione applicata al campione da un

movimento nella cavità orale o nelle dita (per es.: pressione delle dita nel caso di un formaggio).

Soglia (sostantivo):

Soglia assoluta:

quantità minima di uno stimolo sensorio, che origina:

- l'apparizione di una sensazione (soglia di apparizione o di rivelazione);

- o il riconoscimento di detta sensazione (soglia di identificazione).

Soglia differenziale:

quantità minima di stimolo sensorio che genera una differenza percettibile nell'intensità della

sensazione.

Soglia finale:

quantità massima di uno stimolo a decorrere dalla quale un aumento di intensità non si percepisce.

Soglia preferenziale:

valore quantitativo minimo di uno stimolo o valore critico soprallimitare di questo stimolo al quale

corrisponde l'apparizione di una risposta di attrazione o ripulsa rispetto a uno stimolo neutro, per

esempio, nella scelta tra una soluzione zuccherina e l'acqua.

Nota: Devesi dinstinguere tra soglia assoluta di preferenza e soglia differenziale di preferenza.

Sublimitare (aggettivo):

di sotto della soglia appropriata.

Soprallimitare (aggettivo):

di sopra della soglia appropriata.

Fatica sensoria:

caso di adattamento sensoriale che produce una diminuzione della sensibilità.

Compensazione (sostantivo):

risultato dell'interazione dovuta a un complesso di stimoli in modo che ciascuno si percepisca con

minore intensità che se agisse da solo.

Sinergico (aggettivo):

effetto o azione concertata di determinate sostanze, in modo che l'intensità dei caratteri

organolettici risultanti dalla mescolanza è superiore alla somma delle intensità che ciascuno di essi

mostrava separatamente.

Effetto di contrasto:

aumento della risposta alle differenze tra due stimoli simultanei o consecutivi. Contrario dell'effetto

di convergenza.

Effetto di convergenza:

diminuzione della risposta alle differenze tra due stimoli simultanei o consecutivi. Contrario

dell'effetto di contrasto.

2.3.

Terminologia relativa alle proprietà organolettiche



Acido (aggettivo):

a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose diluite della maggioranza degli acidi

(per es.: acidi citrico, lattico e tartarico);

b) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che, all'assaggio, producono questo

sapore.

Il sostantivo corrispondente è acidità.

Agro (aggettivo):

qualifica la sensazione olfatto-gustativa con predominio di acidi generalmente di origine

fermentativa e gli alimenti che producono questa sensazione. Alcuni fattori che contribuiscono a

detta sensazione sono in rapporto con il processo di fermentazione (per esempio acetica o lattica)

di un prodotto alimentare.

Amaro (aggettivo):

a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose diluite di diverse sostanze come la

chinina, la caffeina e determinati eterossidi;

b) qualifica la proprietà di quei corpi puri o loro mescolanze che, all'assaggio, producono questo

sapore.


Il sostantivo corrispondente è amarezza o amaro.

Salato (aggettivo):

a) sensazione caratteristica che si percepisce attraverso il senso del gusto, e il cui esempio più

tipico è quello prodotto da una soluzione di cloruro sodico;

b) qualifica la proprietà dei corpi o delle mescolanze che producono questo sapore durante

l'assaggio.

Il sostantivo corrispondente è salinità.

Dolce (aggettivo):

a) qualifica il sapore elementare prodotto da soluzioni acquose di diverse sostanze, per esempio il

saccarosio;

b) qualifica la proprietà delle sostanze pure o mescolanze che, all'assaggio, producono questo

sapore.


Il sostantivo corrispondente è dolcezza.

Astringente:

a) qualifica la complessa sensazione prodotta nella bocca da una soluzione acquosa diluita di

prodotti come certi tannini (per es.: i tannini del cachi e della prugna);

b) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che producono questa sensazione.

Il sostantivo corrispondente è astringenza.

Flavor (sostantivo):

complesso delle percezioni degli stimoli olfatto-gustativi, tattili e chinestetici che permette di

identificare un alimento e stabilire un criterio, a distinti livelli, favorevole o sfavorevole.

Sapore (sostantivo):

a) sensazioni percepite come conseguenza dello stimolo delle papille gustative da alcune sostanze

solubili;

b) qualità della peculiare sensazione prodotta da tali sostanze.

Sapore elementare (sostantivo):

Ciascuno dei quattro sapori noti: dolce, salato, acido, amaro.

Odore (sostantivo):

a) complesso di sensazioni percepite dall'organo olfattivo quando si inspirano determinate sostanze

volatili;

b) qualità della peculiare sensazione prodotta da ciascuna delle sostanze anteriori.

Aroma (sostantivo):

a) sensazioni gradevoli percepite dall'organo olfattivo per via indiretta all'assaggio di un alimento.

b) in profumeria e nel linguaggio non specializzato si applica anche alle stesse sensazioni percepite

per via nasale diretta.

Retrogusto (sostantivo):

Complesso di sensazioni percepite una volta scomparso lo stimolo dalla bocca, distinte da quelle

previamente percepite.

Aromatico (aggettivo):

a) qualifica la proprietà dei corpi puri o delle mescolanze che, all'assaggio, producono le sensazioni

qualificate come aroma;

b) qualifica quei prodotti che, esaminati per via nasale diretta, producono sensazioni di fragranza e

di fresco.

Struttura (sostantivo):

caratteristiche dello stato solido o reologico di un prodotto, il cui complesso è capace di stimolare

i ricettori meccanici, durante l'assaggio, particolarmente di quelli situati nella cavità orale.

Nota: Questo termine si riferisce soltanto alle proprietà oggettive e non alle sensazioni prodotte e

che si designano con termini generali, come consistenza, fibrosità, untuosità, ecc.

Assaporare:

far che un alimento situato nella bocca entri in contatto con tutte le sue zone sensibili per percepire

le sensazioni orali che produce.

Nota: Questo vocabolario si può ampliare consultando le Norme ISO 5492/I, II, III, IV, V ed

altre esistenti, nonché quello elaborato da J.L. Magnen «Les cahiers techniques du Centre national

de coordination des études et recherches sur la nutrition et l'alimentation», ecc.


BICCHIERE PER L'ASSAGGIO DI OLI 1.

PREMESSA


La presente norma si propone di descrivere le caratteristiche del bicchiere da usare per l'analisi

organolettica degli oli commestibili (odore, sapore, flavor).

Descrive, inoltre, il dispositivo di riscaldamento adattato, necessario per ottenere e mantenere la

temperatura adeguata per quest'analisi.

2.

DESCRIZIONE



Lo schema disegnato della figura 1 vuol migliorare le caratteristiche desiderabili in un utensile di

questa natura, e che possono essere:

a) Massima stabilità, che ostacoli l'inclinazione e il versamento dell'olio contenuto;

b)

Fondo facilmente adattabile alla forma della piastra riscaldante che permetta il riscaldamento



omogeneo della base del bicchiere.

c)

Restringimento della bocca per favorire la concentrazione degli odori e agevolarne l'identificazione.


d)

Vetro oscuro che non permetta all'assaggiatore di percepire il colore dell'olio, per impedirgli così

qualsiasi pregiudizio e la possibile creazione di inclinazioni o tendenze che possano alterare

l'obiettività della determinazione.

2.1.

Dimensioni



Lo schema del bicchiere è rappresentato nella figura 1 ed ha le seguenti dimensioni:

- capacità totale .

130 ml p10 ml,

- altezza totale .

60 mm p1 mm,

- diametro della bocca .

50 mm p1 mm,

- diametro della parte più larga .

70 mm p1 mm,

- diametro della base .

35 mm p1 mm,

- spessore del vetro nelle pareti laterali .

1,5 mm p0,2 mm,

- spessore del vetro nel fondo .

5 mm p1 mm.

Ogni bicchiere sarà accompagnato di un vetro di orologio dal diametro di circa 10 mm maggiore

di quello della bocca. Questo vetro servirà di coperchio per evitare la perdita di aroma e l'entrata

di polvere.

2.2.

Caratteristiche di fabbricazione



Il bicchiere dovrà essere fabbricato con vetro resistente, di colore scuro per impedire

l'apprezzamento della colorazione del suo contenuto, ed esente da strisce o da bolle di fusione.

L'orlo dovrà essere regolare, liscio e rivolto.

Il bicchiere dovrà essere ricotto per resistere alle variazioni di temperatura che dovrà sopportare

durante le prove.

2.3.


Norme per l'uso

La pulizia dei bicchieri dovrà farsi servendosi di sapone o detersivo non profumati, sciacquando

più volte fino ad eliminare il prodotto impiegato. Si sciacqua, infine, con acqua distillata, si lascia

scorrere e si asciuga in una stufa di essiccamento.

Non devono usarsi acidi concentrati né miscela cromica.

I bicchieri devono mantenersi nella stufa fino al momento di usarli, o conservarsi in un armadio al

riparo da qualsiasi contaminazione di odori estranei.

Prima dell'uso bisognerà odorare ogni bicchiere per comprovare l'assenza di qualsiasi odore

estraneo. Al preparare la prova bisognerà avere la precauzione di prendere nota della chiave di

identificazione di ogni bicchiere e dell'olio corrispondente. Questa corrispondenza chiave/olio sarà

nota soltanto all'organizzatore della prova.

3.


Dispositivo di riscaldamento dei campioni

L'esame organolettico dei campioni dovrà farsi a una temperatura determinata che, per gli oli

commestibili, è di 28 oC ± 2 oC. All'interno di ogni cabina dovrà porsi, alla portata

dell'assaggiatore, un dispositivo di riscaldamento come quello della figura 2. Trattasi di un blocco

di alluminio sommerso in un bagno d'acqua regolato termostaticamente, per ottenere una

temperatura uniforme. Questo blocco ha dei vuoti per adattarvi i fondi dei bicchieri. La differenza

di temperatura tra il dispositivo di riscaldamento e l'olio dei bicchieri nei vuoti dei distinti blocchi

deve essere di ± 2 oC.

GUIDA PER L'ALLESTIMENTO DI UNA SALA DI ASSAGGIO 1.

INTRODUZIONE

La sala di assaggio serve ad offrire al gruppo di assaggiatori che intervengono nelle prove sensorie

un ambiente adeguato, comodo e normalizzato che agevoli il lavoro e tenda a favorire la ripetibilità

e la riproducibilità dei risultati.

2.


PREMESSA

La presente norma si propone di determinare le condizioni essenziali di cui bisogna tener conto per

allestire una sala di assaggio.

3.


CARATTERISTICHE GENERALI

La sala, qualunque sia la sua superficie, dovrà rispondere alle seguenti specificazioni:

Dovrà essere gradevole e convenientemente illuminata, mantenendo, però, un carattere neutro. A

tal fine, si raccomanda un colore rilassante, chiaro e a tinta unita nelle pareti per creare

un'atmosfera di distensione (; ).

Dovrà potersi pulire facilmente ed essere isolata da qualsiasi fonte di rumore e, se possibile,

insonorizzata. Sarà anche protetta da odori estranei e provvista di un efficace dispositivo di

ventilazione. Se le oscillazioni della temperatura ambientale lo consigliano, la sala di assaggio dovrà

essere dotata di aria condizionata per mantenere l'ambiente intorno ai 20-22 oC.

3.1.


Dimensioni

Le dimensioni della sala dipendono spesso dalle disponibilità del laboratorio o delle imprese. In

generale, dovrà essere sufficientemente ampia per permettere l'impianto di circa dieci cabine ed

anche di una zona per la preparazione dei campioni.

Tuttavia, più grande è lo spazio dedicato all'impianto, meglio è, perché si potranno prevedere

dipendenze per, ad esempio, pulizia del materiale, collocazione di preparazioni gastronomiche e

riunioni di «panels aperti».

3.2.


Illuminazione

L'illuminazione generale, sia solare, sia elettrica (per esempio, lampade di tubo tipo «luce solare»)

dovrà essere uniforme, regolabile e di luce diffusa.

3.3.


Temperatura e igrometria

La sala sarà sempre in condizioni termiche e igrometriche gradevoli. Tranne in speciali circostanze,

si raccomanda una temperatura di 20-22 oC e un'igrometria del 60/70 % di umidità relativa.

4.


DESCRIZIONE DELLE CABINE

4.1.


Caratteristiche generali

Le cabine di analisi sensoria staranno nella sala una accanto all'altra; saranno tutte uguali e separate

da paraventi abbastanza alti e larghi da isolare gli assaggiatori una volta seduti. Possono costruirsi

con qualsiasi materiale adeguato e di facile pulizia e conservazione (legno, lastre vetrificate,

laminati, ecc.). Se si utilizzano pitture, queste, una volta asciutte, dovranno essere del tutto

inodore.

I sedili in ciascuna cabina dovranno essere comodi e di altezza regolabile.

Bisogna anche prevedere in ciascuna cabina illuminazione individuale regolabile in direzione e

intensità.

Si raccomanda che le cabine siano provviste di un pulsante collegato a un dispositivo luminoso

esterno che permetta all'assaggiatore di comunicare alla persona che si occupa di lui all'esterno,

senza distrarre gli altri, che ha terminato la prova, che desidera altri campioni, che ha bisogno di

qualcosa, che ha osservato qualche irregolarità o desidera qualche informazione, ecc.

(; ) Il colore della stanza e la sua illuminazione possono influire sui risultati dell'analisi sensoria.

4.2.

Dimensioni



Le cabine devono essere abbastanza ampie e comode.

In generale, bisogna attenersi alle seguenti dimensioni:

- Larghezza:

0,75 m (senza lavandino),

0,85 m (con lavandino);

- Profondità:

0,50 m (la tavola),

0,20 m (eccesso del paravento);

- Altezza dei paraventi:

0,60 m, come minimo, (a contare dalla tavola);

- Altezza della tavola:

0,75 m.


4.3.

Disposizione

La superficie della tavola deve essere facile da pulire.

Una parte di detta superficie deve essere riservata per un lavandino con acqua corrente potabile.

Se ciò non fosse possibile, questo spazio servirà per mettere una bacinella, una sputacchiera, o

qualcosa del genere.

Se si devono mantenere i campioni, mentre si realizza la prova, a temperatura costante superiore o

inferiore a quella ambiente, conviene disporre di un'attrezzatura adeguata a tal fine (bagnomaria,

riscaldatore, ecc.).

Si può mettere anche una mensola a più o meno 110 cm dal suolo, per porvi diversi accessori

(bicchieri, piccoli oggetti, ecc.).

Se la disposizione delle cabine nella sala lo consente, conviene aggiungere un dispositivo per

agevolare la presentazione dei campioni, che può essere una porticina scorrevole, (figura 17), una

ruota verticale (figura 2) adatta per bicchieri o coppe (recipienti alti), o a ribalta se i recipienti nei

quali si servono i campioni non sono molto alti (figura 3). Semplicemente, che vi sia un passaggio

sufficiente per i vassoi e i bicchieri che contengono i campioni da esaminare.

5.

DIPENDENZE



Se si dispone di spazio sufficiente, conviene prevedere stanze separate per preparare i campioni

(cucina sperimentale se si prevedono prove gastronomiche o altre), scansie per collocare bicchieri

o utensili e sale di riunioni per le discussioni previe o posteriori alle prove. In tal caso, queste si

manterranno pulite e non dovranno mai molestare con odori, rumori e conversazioni di coloro che

vi fossero riuniti, il lavoro dei giudici nella sala di assaggio.

La figura 4 mostra un esempio di sala di assaggio e di impianti complementari.

Nota: Le condizioni descritte sono le ideali, però se non fosse possibile disporre di una sala del

genere riservata soltanto per analisi sensoria, le prove potrebbero farsi in una stanza che offra le

condizioni minime descritte (luce, temperatura, rumore, odori), allestendo cabine mobili di elementi

pieghevoli tali da permettere di isolare gli assaggiatori.


(1) L'organizzatore del «panel» deve insistere al candidato perché la prova si faccia in maniera

ragionevole, ossia che non vi sia perdita di sensibilità per fatica olfattiva.


ALLEGATO XIII

PROVA DELLA RAFFINAZIONE 1.

NEUTRALIZZAZIONE E DECOLORAZIONE DELL'OLIO D'OLIVA IN LABORATORIO

1.1.


Neutralizzazione dell'olio

1.1.1.


Apparecchiatura

- bicchiere da 300 ml a forma alta,

- centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml,

- bicchiere da 250 ml,

- palloncini da 100 ml,

- imbuto separatore da 1 litro.

1.1.2.

Reattivi


- soluzione acquosa di idrossido di sodio al 12 %,

- soluzione etilalcolica all'1 % di fenolftaleina,

- esano puro per analisi,

- alcool isopropilico per analisi.

1.1.3.

Modo di operare

a) Olio con acidità, espressa in acido oleico, inferiore al 30 %

In un bicchiere da 300 ml a forma alta si pongono 50 g di olio greggio e si riscalda a 65o su

bagnomaria. Sotto lenta agitazione si aggiunge una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12

% corrispondente all'acidità libera dell'olio, con un eccesso del 5 %. Si prosegue l'agitazione per 5

minuti, mantenendo la temperatura a 65o.

Si trasferisce il tutto in provette da centrifuga aventi capacità di 100 ml e si separano le paste

saponose per centrifugazione. Si versa l'olio decantato in un bicchiere da 250 ml e si lava con

50-60 ml di acqua distillata bollente eliminando per sifonamento lo strato acquoso. Si ripetono i

lavaggi sino alla completa rimozione delle tracce di saponi residui (scomparsa della colorazione

rosea alla fenolftaleina).

Si centrifuga l'olio per eliminare le piccole quantità di acqua residua.

b)

Oli con acidità, espressa in acido oleico, superiore al 30 %



In un imbuto separatore da 1 litro si pongono 50 g di olio greggio, 200 ml di esano, 100 ml di

alcool isopropilico e una quantità della soluzione di idrossido di sodio al 12 %, corrispondente

all'acidità libera dell'olio, con un eccesso dello 0,3 %.

Si agita energicamente per 1 minuto. Si aggiungono 100 ml di acqua distillata, si agita nuovamente

e si lascia a riposo. Dopo stratificazione, si allontana lo strato inferiore contenente i saponi. In molti

casi fra i due strati (oleoso superiore, acquoso inferiore), si forma uno strato intermedio, costituito

da mucillagini è di sostanze insolubili che devono parimenti essere allontanate.

Si procede quindi al lavaggio della soluzione esanica dell'olio neutro con porzioni di 50-60 ml di

una soluzione di alcool isopropilico/acqua distillata 1/1 (v/v) fino a scomparsa della colorazione

rosea alla fenolftaleina.

Si allontana quindi completamente l'esano per distillazione sotto vuoto (ad esempio in evaporatore

rotavivo).

1.2.

Decolorazione dell'olio neutralizzato



1.2.1.

Apparecchiatura

- pallone da 250 ml a 3 colli, con attacchi a smeriglio per l'inserimento di:

a) un termometro con divisioni in gradi, permettente misure fino a 90o;

b)

un agitatore meccanico con velocità di rotazione di 250-300 giri/minuto equipaggiato per



funzionare sotto vuoto;

c)

un raccordo per la pompa a vuoto;



- pompa a vuoto, in grado di dare pressioni residue di 15-30 millibar e relativo manometro.

1.2.2.


Modo di operare
Nel pallone a 3 colli si pesano circa 100 g dell'olio neutralizzato. Si inseriscono il termometro e

l'agitatore; si opera il collegamento con la pompa per vuoto e si riscalda fino a 90o agitando, si

mantiene tale temperatura, sempre agitando, sino a quando l'olio in esame non risulti

completamente deacquificato (30 minuti circa).


Si interrompe quindi il vuoto e si aggiungono 2-3 g di terra attivata. Si stabilisce il collegamento

con il vuoto fino a raggiungere una pressione residua di 15-30 millibar, sempre mantenendo la

temperatura a 90o, si agita per 30 minuti intorno ai 250 giri/minuto.
Si filtra poi a caldo in stufa termostatica (50-60o).
ALLEGATO XIV

NOTE COMPLEMENTARI 2, 3 E 4 DEL CAPITOLO 15 DELLA NOMENCLATURA

COMBINATA 1. «Nota 2A: È considerato «olio di oliva» ai sensi dei codici NC 1509 e 1510

solo l'olio proveniente esclusivamente dal trattamento delle olive, escluso l'olio riesterificato e

qualsiasi miscela di olio d'oliva con oli di altra natura.

La presenza di olio di oliva riesterificato o di oli di altra natura viene accertata con i metodi indicati

negli allegati V, VII, IX, X e XII. Le caratteristiche analitiche relative alla composizione sterolica e

acidica comune a tutti gli oli di oliva dei codici NC 1509 e 1510 sono riportate nella tabella

seguente.

. «Note 2A:

TAB I: Tenore in acidi grassi

in % della composizione acidica

TAB II: Tenori in steroli

in % della composizione sterolica

ac. miristicoM 0.1

colesteroloM 0.5

ac. linolenicoM 0.9

brassicasteroloM 0.2

ac. arachicoM 0.7

campesteroloM 4.0

ac. eicosenoicoM 0.5

stigmasterolo < campesterolo

ac. beenicoM 0.3

betasitosterolo (*)m 93.0

ac. lignocericoM 0.5

AE7-stigmastenoloM 0.5

m = minimo

M

= Massimo



(*)

(Delta-5-23-Stigmastadienolo+Clerosterolo+Betasitosterolo+Sitostanolo+Delta-5-Avenasterolo+

Delta-5-24 Stigmastadienolo)
«Nota 2B: Sono considerati «oli di oliva vergini» gli oli ottenuti dal frutto delle olive soltanto

mediante processi meccanici o altri processi fisici, in condizioni, segnatamente termiche, che non

causano alterazioni dell'olio, e che non hanno subito alcun trattamento diverso dal lavaggio, dalla

decantazione, dalla centrifugazione e dalla filtrazione, esclusi gli oli ottenuti dalle olive mediante

solventi (Codice NC 1510), e definiti di seguito ai punti I e II.

II. È considerato «olio di oliva vergine lampante» ai sensi del codice NC 1509 10 10 l'olio che,

indipendentemente dalla sua acidità, presenti:

a) un tenore in alcoli alifatici non superiore a 400 mg/kg;

b)

un tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore a 4,5 %;



c)

un contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non superiore a 1,3 %;

d)

e/o una delle seguenti caratteristiche:



- d1) un numero di perossidi superiore a 20 meq 02/kg;

- d2) un tenore in solventi algogenati volatili totali superiore a 0,2 mg/kg e comunque superiore a

0,1 mg/kg per ciascuno di essi;

- d3)


un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,250 e, dopo trattamento dell'olio su allumina

attivata, non superiore a 0,11. Alcuni oli aventi un tenore in acidi grassi liberi, espresso in acido

oleico, superiore a 3,3 g per 100 g dopo passaggio su allumina attivata, conformemente al metodo

riportato all'allegato XV, possono avere un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,10 in tal

caso, dopo neutralizzazione e decolorazione effettuate in laboratorio, essi debbono presentare le

caratteristiche seguenti:

- un coefficiente di estinzione K270 non superiore a 1.20

- una variazione (DK) del coefficiente di estinzione, in prossimità di 270 nm, superiore a 0.010 e

non superiore a 0.16;

dove:


- Km indica il coefficiente d'estinzione alle lunghezze d'onda del massimo della curva di

assorbimento in prossimità di 270 nm.

DK = Km - (Km+4) + (Km-4)

AEK = Km -

(Km+4) + (Km-4)

2

dove km è il massimo in prossimità di K270



- Km+4e Km-4indicano i coefficienti di estinzione alle lunghezze d'ollanda inferiori o superiori di 4

m a quelle di km (vedi corrigendum).

- d4)

caratteristiche organolettiche che presentino difetti percepibili con un'intensità superiore al limite di



accettabilità, con un punteggio di panel-test inferiore

a 3,5.


II.

È considerato «olio di oliva vergine» ai sensi del codice NC 1509 10 90 l'olio di oliva che presenti

le seguenti caratteristiche:

a)

un'acidità, espressa in acido oleico, non superiore al 3,3 g per 100 g;



b)

un numero di perossidi non superiore a 20 meq 02/kg;

c)

un tenore in alcoli alifatici non superiore a 300 mg/kg;



d)

un tenore in solventi alogenati volatili totali non superiore a 0,2 mg/kg e comunque non superiore a

0,1 mg/kg per ciascuno di essi;

e)

un coefficiente di estinzione K270 non superiore a 0,250 e, dopo trattamento dell'olio su allumina



attivata, non superiore a 0.10;

f)

una variazione (DK) del coefficiente di estinzione, in prossimità di 270 nm, non superiore a 0,010;



g)

caratteristiche organolettiche che presentino difetti anche percettibili con un'intensità inferiore al

limite di accettabilità, con un punteggio di panel-test maggiore di 3,5;

h)

un tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore al 4,5 %;



i)

un contenuto in acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non superiore a 1,3 %.

«Nota 2C:

È considerato come rientrante nel codice NC 1509 90 l'olio di oliva ottenuto dal trattamento degli

oli dei codici NC 1509 10 10 e/o 1509 10 90, anche tagliato con oli di oliva vergini, che presenti

le seguenti caratteristiche:

a) un'acidità, espressa in acido oleico, non superiore a 3,3 g per 100 g;

b)

un tenore di alcoli alifatici non superiore a 350 mg/kg;



c)

un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,250 e non superiore a 1,20 e, dopo passaggio del

campione di olio su allumina attivata, superiore a 0,10;

d)

una variazione (DK) del coefficiente di estinzione, in possimità di 270 nm, superiore a 0,10 e non



superiore a 0,16;

e)

un tenore in eritrodiolo + uvaolo non superiore a 4,5 %;



f)

un contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 non superiore a 1,5 %.

«Nota 2D:

Sono considerati «oli greggi» del codice NC 1510 00 10 gli oli, e particolarmente gli oli di sansa,

che presentano le seguenti caratteristiche:

a)

un'acidità, espressa in acido oleico, superiore a 2 g per 100 g;



b)

un tenore in eritrodiolo + uvaolo superiore al 12 %;

c)

un contenuto in acidi grassi saturi in posizione 2 dei trigliceridi non superiore a 1,8 %.



«Nota 2E:

Sono considerati oli del codice NC 1510 00 90 gli oli ottenuti dal trattamento degli oli del codice

NC 1510 00 10, anche se tagliati con oli di oliva vergini, non aventi le caratteristiche degli oli di cui

ai punti I, II, a condizione che presentino un contenuto di acidi grassi saturi in posizione 2 dei

trigliceridi non superiore al 2 %.»

2. «Nota 3: Sono esclusi dai codici NC 1522 00 31 e 1522 00 39:

a) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell'olio per il quale

l'indice di iodio, determinato secondo il metodo indicato all'allegato XVI, è inferiore a 70 o

superiore a 100;

b)

i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell'olio per il quale l'indice



di iodio è compreso tra 70 e 100, ma la culi superficie del picco corrispondente al volume di

ritenzione del beta-sitosterolo determinata conformemente alle disposizioni dell'allegato V del

regolamento di cui alla seguente nota complementare 4 rappresenta meno del 93 % della

superficie totale del picchi degli steroli.

3.

«Nota 4:



I metodi di analisi per la determinazione delle caratteristiche dei prodotti di cui sopra sono quelli

previsti agli allegati del regolamento (CEE) n. 2568/91.»


ALLEGATO XV

1.


METODO DI DETERMINAZIONE DEL TENORE IN OLIO D'OLIVA DELLE SANSE

1.1.


Materiale

- apparecchio da estrazione appropriato, munito di un pallone da 200-250 ml,

- bagno a riscaldamento elettrico (bagno a sabbia, bagno ad acqua, ecc.) o piastra riscaldante,

- bilancia analitica,

- stufa regolata su un massimo di 80 oC,

- stufa a riscaldamento elettrico, provvista di un dispositivo di termoregolazione regolato su 103

p 2 oC e tale da consentire una insufflazione d'aria o una depressione,

- frantoio meccanico facile da pulire, che permette la frantumazione dei noccioli senza

riscaldamento e senza modificazione sensibile del loro tenore in acqua e in olio,

- ditale da estrazione e cotone idrofilo o carta da filtro, esenti da sostanze estraibili con esano,

- essiccatore,

- setaccio a maglie da 1 mm di diametro,

- pietra pomice in granuli, previamente essiccata.

1.2.


Reattivo

n-esano tecnico, il cui residuo all'evaporazione completa dev'essere inferiore a 0,002 g/100 ml.

2.

MODO DI OPERARE



2.1.

Preparazione del campione per l'analisi

Frantumare il campione contrattuale, se necessario, nel frantoio meccanico ben pulito in

precedenza, allo scopo di ridurlo in particelle che attraversino completamente il setaccio.

Utilizzare ; /20 circa del campione per completare la pulizia del frantoio, scartare il prodotto di

questa macinazione, frantumare il resto, raccoglierlo, mescolarlo con cura e analizzarlo

immediatamente.

2.2.


Quantità di sostanza da analizzare

Immediatamente dopo la fine della frantumazione, pesare con l'approssimazione di 0,01 g circa 10

g del campione.

2.3.


Preparazione del ditale da estrazione

Porre la sostanza destinata all'analisi nella cartuccia, che va tappata con il tampone di cotone

idrofilo. Nel caso che si utilizzi una carta da filtro, impacchettare le sanse frantumate in tale carta.

2.4.


Preessiccazione

Se la sansa è molto umida (tenore in acqua ed in sostanze volatili superiore al 10 %), effettuare

un'essiccazione preliminare ponendo per un tempo conveniente il ditale riempito (o la carta da

filtro) nella stufa riscaldata ad un massimo di 80 oC, per ricondurre il tenore in acqua ed in materie

volatili al di sotto del 10 %.

2.5.


Preparazione del pallone

Pesare con l'approssimazione di 1 mg il pallone contenente 1-2 granuli di pomice, previamente

essiccato in stufa a 103 p2 oC e poi raffreddato per almeno un'ora in essiccatore.

2.6.


Prima estrazione

Porre nell'apparecchio da estrazione il ditale (o la carta da filtro) contenente la sostanza da

analizzare. Versare nel pallone la quantità necessaria di esano. Adattare il pallone all'apparecchio

da estrazione e porre il tutto sul bagno a riscaldamento elettrico. Effettuare il riscaldamento in

condizioni tali che la portata del riflusso sia di almeno tre gocce al secondo (ebollizione moderata,

non tumultuosa).

Dopo quattro ore di estrazione, lasciar raffreddare. Togliere il ditale dall'apparecchio di estrazione

e porlo in una corrente d'aria, al fine di eliminare la maggior parte del solvente che lo impregna.

2.7.

Seconda estrazione



Vuotare il ditale nel microfrantoio e macinare il più finemente possibile. Reintrodurre

quantitativamente la miscela nel ditale e rimettere questo nell'apparecchio da estrazione.

Ricominciare l'estrazione per altre due ore, utilizzando lo stesso pallone che contiene la prima

sostanza estratta.

La soluzione ottenuta nel pallone da estrazione dev'essere limpida. Se così non fosse, filtrarla su

carta, lavando più volte il primo pallone e la carta da filtro con esano. Raccogliere filtrato e

solvente di lavaggio in un secondo pallone, previamente essiccato e tarato con l'approssimazione

di 1 mg.

2.8.

Eliminazione del solvente e pesata dell'estratto



Eliminare la maggior parte del solvente distillato su bagno a riscaldamento elettrico. Eliminare le

ultime tracce di solvente riscaldando il pallone in stufa a 103 p2 oC per 20 minuti. Facilitare questa

eliminazione sia insufflando ogni tanto dell'aria o, preferibilmente, del gas inerte, sia operando sotto

pressione ridotta.

Lasciar raffreddare il pallone in essiccatore per almeno un'ora, poi pesarlo con l'approssimazione

di 1 mg.

Riscaldare di nuovo per 10 minuti nelle stesse condizioni, poi raffreddare in essiccatore e pesare.

La differenza fra i risultati di queste due pesate dev'essere inferiore od uguale a 10 mg. In caso

contrario, riscaldare di nuovo per periodi di 10 minuti, seguiti da raffreddamento e pesata, finché la

differenza di massa sia uguale tutt'al più a 10 mg. Adottare per il calcolo il valore dato dall'ultima

pesata.

Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.

3.

ESPRESSIONE DEI RISULTATI



3.1.

Modo di calcolo e formula

a) L'estratto, espresso come massa percentuale sul prodotto tal quale, è dato dalla formula:

a) S = m1 × 100

S = m1 ×

100


m0

nella quale:

S = percentuale in massa sul prodotto tal quale,

m0

= massa in grammi della quantità di sostanza prelevata per l'analisi,



m1

= massa in grammi dell'estratto dopo essiccazione.

Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni, se le condizioni di ripetibilità

sono adempiute.

Esprimere il risultato con una sola cifra decimale.

b)

L'estratto viene riferito alla sostanza secca utilizzando la formula seguente:



a) S = 100 - U = estratto in % grasso/secco

S ×


100

100 - U


= estratto in % grasso/secco

dove:


S = percentuale in massa di estratto sul prodotto tal quale (vedi lettera a),

U

= suo tenore in acqua e in sostanze volatili.



3.2.

Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o in rapida successione

dallo stesso analista non deve eccedere i 0,2 g di estratto ottenuto con l'esano per ogni 100 g di

campione.

In caso contrario, ripetere l'analisi su due altri quantitativi di sostanza. Se ancora questa volta la

differenza eccede gli 0,2 g, assumere come risultato la media aritmetica delle quattro

determinazioni effettuate.


ALLEGATO XVI

DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI IODIO 1.

OGGETTO

La presente norma internazionale definisce un metodo per la determinazione del numero di iodio

nei grassi e negli oli di origine animale e vegetale, qui di seguito denominati «grassi».

2.


DEFINIZIONE

Ai fini della presente norma internazionale, si applica la seguente definizione.

2.1.

Numero di iodio: la massa di iodio assorbita dal campione nelle condizioni specificate nella



presente norma internazionale.

Il numero di iodio viene espresso in grammi di iodio per 100 g di campione.

3.

PRINCIPIO



Scioglimento della sostanza da analizzare nel solvente ed aggiunta di reagente di Wijs. Trascorso

un certo lasso di tempo, aggiunta di soluzione di ioduro di potassio e di acqua e titolazione dello

iodio liberato con soluzione di tiosolfato di sodio.

4.


REAGENTI

Tutti i reagenti devono essere di grado analitico riconosciuto.

4.1.

Ioduro di potassio, soluzione di 100 g/l, non contenente iodato o iodio libero.



4.2.

Amido, soluzione.

Versare 5 g di amido solubile in 30 ml d'acqua, aggiungere questa miscela a 1 000 ml di acqua

bollente, fare bollire per 3 minuti e lasciar raffreddare.

4.3.

Tiosolfato di sodio, soluzione volumetrica standard c (Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l,



standardizzato non oltre 7 giorni prima dell'uso.

4.4.


Solvente, preparato miscelando volumi eguali di cicloesano e di acido acetico.

4.5.


Reagente di Wijs, contenente monocloruro di iodio in acido acetico. È opportuno usare il reagente

di Wijs disponibile in commercio.

Nota: Il reagente contiene 9 g di ICl3 + 9 g di I in acido acetico.

5.


APPARECCHIATURA

La consueta apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.

5.1.

Ditali da pesata, in vetro, idonei per la sostanza da analizzare e per l'inserimento nelle beute (5.2).



5.2.

Beute, aventi una capacità di 500 ml, provviste di tappi in vetro smerigliato e completamente

asciutte.

6.


PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI SOSTANZA DA ANALIZZARE

Il campione omogeneizzato è seccato su solfato sodico e filtrato.

7.

PROCEDIMENTO



7.1.

Sostanza da analizzare

Il peso della sostanza da analizzare varia a seconda del numero di iodio che si prevede, come

indicato nella tabella 1.

Tabella 1

Numero di iodio previsto

massa della sostanza da analizzare

g

inferiore a 5



da 5 a 20

da 21 a 50

da 51 a 100

da 101 a 150

da 151 a 200

3,00


1,00

0,40


0,20

0,13


0,10
Pesare la sostanza da analizzare con l'approssimazione di 0,1 mg in un ditale da pesata in vetro

(5.1).


7.2.

Determinazione

Versare la sostanza da analizzare in una beuta da 500 ml (5.2). Aggiungere 20 ml del solvente

(4.4) in modo da sciogliere li grasso. Aggiungere esattamente 25 ml del reagente di Wijs (4.5),

inserire il tappo, agitare il contenuto e riporre la beuta al buio. Per il reagente di Wijs non usare

una pipetta a bocca.

Analogamente preparare un bianco col solvente ed il reagente, ma tralasciando la sostanza da

analizzare.

Per le sostanze aventi un numero di iodio inferiore a 150, mantenere le beute al buio per un'ora;

per quelle aventi un numero di iodio superiore a 150 nonché per i prodotti polimerizzati oppure

per i prodotti notevolmente ossidati, lasciar riposare per due ore.

Trascorso il periodo necessario, aggiungere 20 ml della soluzione di ioduro di potassio (4.1) e 150

ml di acqua a ciascuna delle beute.

Titolare con la soluzione volumetrica standard di tiosolfato di sodio (4.3) finché la colorazione

gialla dovuta allo iodio non sia quasi scomparsa. Aggiungere alcune gocce della soluzione di amido

(4.2) e continuare la titolazione finché la colorazione blu sia appena scomparsa a seguito di

agitazione molto vigorosa.

Nota - È consentita la determinazione potenziometrica del punto finale.

7.3.

Numero di determinazioni



Effettuare due determinazioni sullo stesso campione.

8.


ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il numero di iodio viene dato dalla seguente espressione:

12,96 c (V1-V2)

12,69 c (V1-V2)

m

Dove:


c1 = è il numerico della concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione di Tiosolfato di

sodio Titolata (5.4) utilizzata;

V1

=

è il valore numerico del volume, in ml, della soluzione di Tiosolfato di sodio Titolata (5.4) utilizzata;


V2

=

è il valore numerico del volume, in ml, delle soluzioni di Tiosolfato di sodio (5.4) utilizzato per la



determinazione;

m

=



è il valore numerico del peso, in g, della sostanza da analizzare (7.1).

Prendere come risultato la media aritmetica di due determinazioni.


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