Relazione Scientifica Short-Term mobility 2008


Impostazione lavoro sperimentale



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14.02.2020
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Impostazione lavoro sperimentale
Il lavoro sperimentale svolto durante il soggiorno presso l’Università di Warwick ha riguardato il miglioramento delle tecniche di estrazione e purificazione delle proteine extracellulari del suolo.
Per tali studi è stato selezionato un terreno naturale estremamente ricco di sostanza organica (5%), non coltivato e non sottoposto ad azione antropica.
Metodiche utilizzate
Estrazione delle proteine extracellulari

In base ai risultati ottenuti dai precedenti studi effettuati in collaborazione con il gruppo Inglese ospitante si è deciso di utilizzare il k2SO4 per l’estrazione delle proteine libere del suolo ed il sodio pirofosfato per quelle legate alle sostanze umiche (Masciandaro et al., 2008).


Estrazione in pirofosfato

Il sodio pirofosfato 0,1M pH 7,1 è stato aggiunto in rapporto 1:3 (p/v), l’estrazione è stata condotta a 37°C per 24 h in agitazione in bagno termostatico con 200 oscillazioni per minuto (Masciandaro et al., 2008).

EDTA 10 mM è stato aggiunto durante l’estrazione come inibitore di metallo proteasi (Tabatabai e Fu, 1992).
Estrazione in solfato di potassio

Il solfato di potassio (K2SO4) 0,5M pH 6,6 è stato aggiunto in rapporto 1:3 (p/v), l'estrazione è stata condotta a temperatura ambiente per 1h in agitazione in bagno termostatico con 200 oscillazioni per minuto (Masciandaro et al., 2008).

EDTA 10 mM è stato aggiunto durante l’estrazione come inibitore di metallo proteasi (Tabatabai e Fu, 1992).
Trattamento del campione in seguito alle estrazioni

Dopo l’estrazione (in pirofosfato neutro o in solfato di potassio) il campione è stato centrifugato per 15 minuti a 12000 xg e il surnatante, con lo scopo di rimuovere la componente cellulare, è stato filtrato mediante membrana batteriologica 0,22 µm (Masciandaro e Ceccanti, 1999). Dopo una diluizione di circa 3 volte il campione è stato sottoposto a dialisi, mediante membrane da dialisi 3.500 PM a 4°C per circa 48 ore con lo scopo di rimuovere i sali che avrebbero interferito con la tecnica di SDS-PAGE.

Il campione dializzato è stato poi sottoposto a concentrazione mediante membrane Amicon PM-10 sotto pressione d’azoto; questo ha comportato l’allontanamento dal campione della frazione con peso molecolare inferiore ai 10.000 Da (Ceccanti et al.,1989).
Il campione così ottenuto è stato è sottoposto a due diversi trattamenti:


  • Concentrazione spinta: Concentrazione mediante membrana Amicon PM-10, fino al raggiungimento di un volume di 500 µl.

  • Precipitazione: Le proteine nell’estratto sono state precipitate tramite il metodo DOC-TCA (deossicolato-acido tricloroacetico) (HUJI, 2006). DOC al 2% è stato aggiunto all’estratto in rapporto 1:100 v/v per 1h a 4 °C. Successivamente è stato aggiunto TCA al 100% (454 ml H2O/kg TCA) in rapporto 1:10 v/v, la precipitazione è stata condotta a -20 °C O/N. Dopo l'incubazione il campione è stato centrifugato a 14600 xg per 15min a 4 °C e il surnatante è stato rimosso. Il pellet è stato risospeso in 10 ml di acetone freddo e posto a -20 °C per 1h. Dopo un’ulteriore centrifuga nelle medesime condizioni della precedente si è effettuato un’ulteriore lavaggio in 1 ml di acetone freddo. Il campione è stato trasferito in eppendorf, centrifugato a 13.000 xg per 15 min a 4 °C ed infine il pellet è stato risospeso in 200 µl di sample buffer.


Purificazione

Alcuni campioni prima dei processi di concentrazione spinta e precipitazione DOC/TCA sono stati sottoposti ad un processo di purificazione per rimuovere, almeno in parte, le sostanze umiche dall'estratto concentrato.

Il campione è stato purificato grazie alla diretta aggiunta di polivinipirrolidone (PVP) in polvere in rapporto 1:10 (p/v).

L’incubazione si è svolta per 15 minuti a temperatura ambiente in agitazione, sia PVP che campione erano stati precedentemente acidificati con H2SO4 rispettivamente 0,25 M e 0,025 M.

Il surnatante ottenuto è stato filtrato attraverso membrane battereologiche 0,22 m per allontanare i residui del polimero insolubile rimasti nell’estratto.




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