Relazione Scientifica Short-Term mobility 2008



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14.02.2020
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Trattamento fisico

In seguito alla filtrazione su membrana batteriologica, e prima della desalificazione, alcuni campioni sono stati sottoposti ad un trattamento fisico mirato a rompere le interazioni tra proteine e fenoli. L’estratto è stato riscaldato per circa 5 min a 70 °C, subito dopo raffreddato in un bagno ghiacciato ed infine congelato a -20 °C per 72 ore con un breve scongelamento del campione ogni 24 ore e successivo ricongelamento (Barcello, Munoz, Sabater. 1987).


SDS-PAGE
Resolving gel: 12% (10 ml)

_ Acqua 4,4 ml

_ Tris-HCl pH 8,8 1,5 M 2,5 ml

_ SDS 10% 0,1 ml

_ Acrilammide/Bis 40% 3 ml

_ APS 10% 50 µl

_ TEMED 5 µl
Stacking gel: 4% (10 ml)

_ Acqua 6,425 ml

_ Tris-HCl pH 6,8 0,5 M 2,5 ml

_ SDS 10% 0,1 ml

_ Acrilammide/Bis 40% 0,975 ml

_ APS 10% 50 µl

_ TEMED 10 µl
Buffer di risospensione 1X

Tris-HCl 0,5M pH 6,8

SDS 10%

Glicerolo 25%


Running buffer: Laemmli buffer 5X (Leamli, 1970)

Tris-HCl 312,5 mM pH 6,8

SDS 10%

Glicerolo 50%

Blu di bromofenolo 2,5%

DTT 7,7%
Tampone di corsa 10x (Tris-Glicina) pH 8,3 (1 L)

Tris base 30,3 g

SDS 10,0 g

Glicina 144 g
Corsa elettrioforetica

A 30 µl di campione sono stati aggiunti 6 µl di sample buffer 5X, riscaldati a 100 °C per 3 minuti, centrifugati per altri 3 minuti ed infine caricati direttamente nei pozzetti dello stacking gel.

Durante i primi 5 minuti di corsa è stato applicato un voltaggio di 80 V per permettere alle proteine di compattarsi nello stacking, successivamente il valore è stato portato a 150 V e la corsa è stata condotta per circa 1 ora e mezzo.
Colorazioni


  • Per la colorazione Blu di coomassie è stato utilizzato un preparato “Instant blu” della “Generon”, che richiedeva la sola incubazione del gel in questa soluzione per 15 minuti.

  • Per la colorazione Silver è stato seguito il seguente protocollo:




    • Fissaggio delle proteine per 30 minuti con etanolo 30%, acido orto fosforico 2%

    • Lavaggio in acqua per 5 minuti.

    • Soluzione etanolo 40%, acido acetico 10%, acqua 50% per 1 ora

    • Soluzione etanolo 5%, acido acetico 5%, acqua 90% per 2 ore.

    • Lavaggio in acqua di 5 minuti.

    • Incubazione con soluzione di Gluteraldeide 1% in acetato di sodio 6,8% per 30 minuti.

    • Tre lavaggi in acqua di 10 minuti ciascuno.

    • Soluzione contenente nitrato d’argento ammoniacale (0,8g di AgNO3 in 4 ml di acqua + 21 ml di acqua + 1 ml di ammoniaca + 0,2ml di NaOH 10N, + gocce d'ammoniaca fino a far scomparire il precipitato di argento. Volume finale di 100ml) per 30 minuti.

    • Quattro lavaggi in acqua di 4 minuti ciascuno.

    • Sviluppo (formalina 0,25% in acido citrico 0,01%) per il tempo necessario per la visualizzazione delle bande

    • Blocco sviluppo al comparire delle bande con acido acetico 5%

    • Conservazione in acqua.


Decolorazione del Blu coomassie
Immergere il gel in una soluzione di etanolo 30% e incubare per 20 minuti a 60-70°C. Ripetere il procedimento, cambiando la soluzione, per 2 o tre volte, fino alla scomparsa del colore blu.
Determinazione della concentrazione proteica
Metodo Lowry (Lowrry, 1951)

Soluzione A: 2% Na2CO3 in 0,1N NaOH

Soluzione B: 1% NaK Tartrato in H2O

Soluzione C: 0.5% CuSO4. 5H2O in H2O

Soluzione D: 48 ml A + 1 ml B+ 1ml C

Soluzione E: Phenol reagent 2N (1 parte Phenol reagent + 1 parte di acqua).


A 100 µl di campione si aggiungono 2 ml della soluzione D e dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente si uniscono 200 µl della soluzione E. Dopo 30 minuti si effettua una lettura spettrofotometrica a 600 nm.
A causa della presenza delle sostanze umiche negli estratti concentrati si è resa necessaria la costruzione di rette di correzione, con lo scopo di sottrarre l’interferenza data dalle stesse sulla colorazione Lowry.
Dato che le sostanze umiche sono di per sé colorate è stata costruita una retta di assorbanza in funzione della loro concentrazione (fig.1, retta standard, curva rossa).

Un’altra curva è stata costruita sottoponendo le sostanze umiche standard a colorazione Lowry dato che le sostanze umiche, così come le proteine, reagiscono con i prodotti del lowry colorandosi di azzurro (fig. 1, curva blu).



Del campione incognito tal quale (estratto proteico) veniva determinata la concentrazione degli acidi umici utilizzando la curva standard (fig.1, curva rossa), da questa concentrazione, sulla retta blu, è stato possibile risalire l’assorbanza degli acidi umici dopo colorazione Lowry. Sottraendo questa assorbenza (acidi umici) a quella del campione sottoposto a colorazione lowry (proteine più acidi umici) ottenevamo il valore di assorbenza dovuto alle sole proteine. La concentrazione delle proteine veniva poi determinata dalla retta di calibrazione dell’albumina (fig.2).

Fig.1 Retta di assorbanza in funzione della concentrazione delle sostanze umiche (curva rossa) e retta di assorbenza in funzione della concentrazione delle sostanze umiche sottoposte alla colorazione Lowry (curva blu).

Fig. 2. Retta di calibrazione dell’albumina per la determinazione della concentrazione proteica.






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