Relazione Scientifica Short-Term mobility 2008



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In occasione del soggiorno effettuato presso l’università di Warwick (Coventry, UK), sono stati condotti i seguenti studi coordinati dalla Prof. Elizabeth M H Wellington.
Nel primo gel (fig.3) è stato caricato il campione sottoposto ai seguenti trattamenti:
K2SO4: Estrazione in K2SO4, purificazione con PVP e precipitazione DOC/TCA.

PPi: Estrazione in pirofosfato, purificazione con PVP e precipitazione DOC/TCA.

K2SO4C: Estrazione in K2SO4, purificazione con PVP e concentrazione spinta.

PPiC: Estrazione in pirofosfato, purificazione con PVP e concentrazione spinta.


Questo gel era stato colorato con il blu di coomassie ma a causa della scarsa concentrazione delle proteine nessuna banda era stata osservata. Questo ha reso necessario una decolorazione del gel e l’applicazione di una colorazione più sensibile quale quella con nitrato d’argento (Silver Staining).

Quello che si può osservare è che nessuna banda è stata rilevata nei campioni sottoposti a concentrazione spinta mentre per entrambi quelli sottoposti a precipitazione, ed in particolare nell’estratto in pirofosfato, si sono osservate due bande in corrispondenza di 55 e 72 KDa.




Marker proteici

KDa
250

130

95

72



55
36
28

17

11




K2SO4 PPi K2SO4C PPic

Fig.3. Estratti in K2SO4 e pirofosfato sottoposti a concentrazione spinta (K2SO4c; PPiC) o precipitazione DOC/TCA (K2SO4; PPi:) dopo purificazione con PVP. Colorazione Silver.


Altre prove sono state effettuate eliminando il passaggio di purificazione in PVP e utilizzando come estraente K2SO4 in modo da avere un minor contenuto di sostanze umiche. Dopo l’estrazione in solfato di potassio il campione è stato suddiviso in 2 aliquote; un’aliquota è stata sottoposta a precipitazione DOC/TCA (P1D; P2D) e l’altra aliquota a concentrazione spinta con membrane Amicon PM-10 (P1C; P2C).

La prova è stata effettuata in doppio (P1; P2). Le bande rilevate (fig.4) sono le stesse del gel precedente, ma si può osservare come l’eliminazione del passaggio di purificazione in PVP determini, in entrambi i casi, il recupero di un quantitativo di proteine notevolmente superiore, anche se è evidente un sottofondo scuro dato dalla presenza degli acidi umici. Per rendere ben evidenti le bande nei campioni concentrati la colorazione Silver è stata condotta per un tempo più lungo e questo ha determinato una colorazione eccessiva dei campioni sottoposti a precipitazione, rendendo le bande, che in realtà erano molto nette e definite, poco visibili, ma questo è dovuto anche alla bassa qualità della foto.




Marker proteici

KDa
250

130

95

72



55

36
28


17






P1D P1c P2D P2c P2c

Fig.4 Estratto in K2SO4 sottoposto a concentrazione spinta (P1C; P2C) o precipitazione DOC/TCA (P1D; P2D). Metodica effettuata in doppio (P1; P2). Colorazione Silver.


L’elevata concentrazione delle proteine nei campioni sottoposti a precipitazione ha consentito l’identificazione delle bande anche con colorazione blu di coomassie (fig.5); questo ci consentirà di sequenziare le bande mediante HPLC-ESI-MS/MS.


Marker proteici

KDa
250

130

95

72


55

36
28


17




P1D P1c P2D P2c

Fig.5 Estratto in K2SO4 sottoposto a concentrazione spinta (P1C; P2C) o precipitazione DOC/TCA (P1D; P2D). Metodica effettuata in doppio (P1; P2). Colorazione Blu di Coomassie.


La concentrazione proteica rilevata in questi campioni è riportata in tabella 1. Come era prevedibile la metodica che ha determinato il maggior recupero di proteine è stata quella con la precipitazione e senza passaggio di purificazione in PVP (P1D; P2D). Il trattamento con DOC e TCA determina però una denaturazione delle proteine che non possono quindi essere valutate mediante test enzimatici. Questo problema non si presenta per il campione sottoposto alla semplice concentrazione dove, invece, le proteine dovrebbero rimanere attive. La concentrazione spinta effettuata dopo purificazione con PVP non ha determinato la rivelazione di proteine come era prevedibile dall’assenza di bande proteiche nel gel di SDS-PAGE (fig.3).


Campione

mg BSA/ml

K2SO4

3,16

PPi

3,14

K2SO4C

0,00

PPiC

0,00

P1D

6,59

P1C

2,69

P2D

5,47

P2C

2,89

Tabella1. Concentrazione delle proteine negli estratti.

K2SO4: Estrazione in K2SO4, purificazione con PVP e precipitazione DOC/TCA.

PPi: Estrazione in pirofosfato, purificazione con PVP e precipitazione DOC/TCA.

K2SO4C: Estrazione in K2SO4, purificazione con PVP e concentrazione spinta.

PPiC: Estrazione in pirofosfato, purificazione con PVP e concentrazione spinta.

P1D; P2D: Estratto in K2SO4 sottoposto a precipitazione DOC/TCA.



P1C; P2C: Estratto in K2SO4 sottoposto a concentrazione spinta.
Il trattamento fisico a cui è stato sottoposto l’estratto in solfato di potassio, con lo scopo di rompere i legami tra proteine e sostanze umiche (fig. 6), non ha evidenziato differenze da un punto di vista qualitativo o quantitativo nella purificazione delle proteine. Anche se in questo caso è stato utilizzato un marker proteico differente (200KDa-6.5KDa), le bande rilevate sono localizzate intorno a 80-60 KDa come per i trattamenti precedenti