Separazione dei pigmenti del cloroplasto e determinazione dello spettro di assorbimento. Misura della clorofilla a,b e totale



Scaricare 44.76 Kb.
17.12.2017
Dimensione del file44.76 Kb.


I PIGMENTI fotosintetici: analisi cromatografica e spettro di assorbimento; determinazione spettrofotometrica della concentrazione della clorofilla a, b e totale

Scopo dell'esercitazione è l'estrazione dei pigmenti dei cloroplasti di foglie di spinacio (o di altra specie), la loro separazione tramite TLC e la determinazione degli spettri di assorbimento nell'intervallo di lunghezze d'onda 350-700 nm. Inoltre verrà determinata la concentrazione delle clorofille a e b e della clorofilla totale nelle foglie di spinacio utilizzando la diversa assorbanza nel rosso (massimi di assorbimento a 663.6 e 646.6 nm) delle due forme.


INTRODUZIONE

I cloroplasti di tutte le Piante superiori contengono 2 classi principali di pigmenti che assorbono l'energia solare e partecipano direttamente o indirettamente al processo fotosintetico. Questi pigmenti sono le clorofille verdi (a e b) e i carotenoidi (normalmente rossi, arancione o gialli).

Caratteristica dei pigmenti, da cui deriva il loro nome, è quella di assorbire la radiazione elettromagnetica solare nell'intervallo di l 400-700, lo stesso percepito dall'occhio umano. L'assorbimento della radiazione visibile è reso possibile dall'esteso sistema di doppi legami coniugati che caratterizza la molecola di tutti i pigmenti in conseguenza del quale si riduce il livello energetico della molecola eccitata. In tal modo anche la radiazione visibile (a l alte e perciò ad energia minore), in accordo con la teoria quantistica, riesce ad eccitare la molecola di pigmento e quindi può essere utilizzata per il lavoro fotochimico.

Grazie alle caratteristiche di assorbimento dei pigmenti fotosintetici le piante riescono ad utilizzare le radiazioni più abbondanti dello spettro solare convertendole in energia chimica di legame nel processo fotosintetico.

La maggior parte dei pigmenti del cloroplasto non effettua lavoro fotochimico ma partecipa alla
raccolta della luce (antenne). Una clorofilla dell'antenna ed eccitata da un fotone trasferisce
l'eccitazione ad altre clorofille, secondo un gradiente decrescente di energia di eccitazione (e quindi di l crescenti della luce assorbita) ed infine alla clorofilla a dei centri di reazione (P680 o P700).

Le clorofille a e b sono i pigmenti più abbondanti delle piante. Le clorofille hanno una struttura porfirinica formata da 4 anelli pirrolici chelati al centro con un atomo di Mg2+ ed una catena lineare di 20 atomi di carbonio, il fitolo, esterificato con il gruppo carbossilico di un residuo di acido propionico legato al IV anello pirrolico (vedi figura). La differenza tra clorofilla a e b consiste nella presenza nella prima di un gruppo metilico al posto di un gruppo aldeidico nell'anello II: ciò rende la clorofilla a leggermente più solubile della clorofilla b in solventi non polari come l’esano. Questa caratteristica può essere utilizzata per separare cromatograficamente le due clorofille. La catena idrocarburica non polare del fitolo ha la funzione di ancorare la molecola di clorofilla alla porzione idrofobica della membrana del tilacoide.

La clorofilla a ha una colorazione blu-verde e la clorofilla b giallo-verde: il loro spettro di assorbimento della luce fra 350-700 nm è infatti leggermente diverso. Entrambe hanno massimi di assorbimento nel blu-violetto (intorno a 450 nm) e nel rosso (650-700 nm) e minimi nel verde e nel giallo (500-600 nm); i picchi della clorofilla b si trovano all'interno rispetto a quelli della clorofilla a (nella zona del rosso il massimo di assorbimento della clorofilla b, in acetone, corrisponde alla l a 646.6 anzichè 663.6 nm, tipica della clorofilla a). Va notato che la clorofilla a nella cellula intatta mostra molti picchi di assorbimento a l superiori: 670, 680, 685, 690 e tra 695 e 720 nm. Questi picchi non sono dovuti alla presenza di forme molecolari diverse di clorofilla a ma costituiscono spostamenti di spettro dovuti alle interazioni con proteine o ad aggregazioni.

Il rapporto tra le due clorofille nelle piante superiori e nelle alghe verdi è spesso di 2-3 clorofille a per una clorofilla b, ma varia in relazione alle condizioni ambientali.

I carotenoidi sono composti lipidici a 40 atomi di C presenti in quantità diversa in quasi tutte le piante superiori. Benchè in una singola specie siano presenti carotenoidi di struttura diversa, essi possono essere classificati in 2 tipi principali: i caroteni e i caroteni ossigenati o xantofille (vedi figura). I caroteni sono idrocarburi non ossigenati, ad esempio il b carotene (il carotene più abbondante nelle piante superiori) ha formula empirica C40H56. Le xantofille (due volte più abbondanti dei caroteni nelle foglie) contengono invece ossigeno negli anelli terminali ed hanno, in genere, formula empirica C40H56O2.

La funzione dei carotenoidi nel cloroplasto è duplice: ampliano lo spettro delle radiazioni utilizzate nel processo fotosintetico ed evitano la distruzione fotoossidativa della clorofilla. Piante senza carotenoidi non sopravvivono alla luce. La maggior parte dei carotenoidi è di colore giallo, arancio, rosso e molti dei vivaci colori dei petali fiorali e la colorazione autunnale delle foglie sono dovuti alla loro presenza.



MATERIALI

- Foglie di spinacio o altra specie (o di Arum italicum), 0.5 g

- Acetone, 80 ml

- Imbuto Buchner, filtro di carta Whatman oppure centrifuga

- Omogeneizzatore (oppure mortaio e pestello)

- 1 cilindro da 100 ml

- solfato di magnesio anidro, 0.5 g

- 1 lastra per TLC, 5 x 20 cm, spessore 0.25 mm, preparata con silica gel G

- Spettrofotometro

- Microsiringhe, pipette Pasteur, beute e tubi in vetro.


PROCEDURA

ESTRAZIONE E SEPARAZIONE DEI PIGMENTI TRAMITE TLC

- Con un bisturi tagliare la lamina fogliare scartando le nervature più grosse. Pesare 0.5 g di questo materiale, aggiungere 0.5 g di solfato di magnesio anidro e 1 g di sabbia silicea. Macerare il materiale fino ad ottenere una polvere verde. Trasferire in tubo di vetro, aggiungere 2 ml di acetone, agitare e lasciare in estrazione per 10 min.

- Centrifugare a 4000g per 5 minuti (in tubi Corex). Separare l’estratto liquido dal residuo solido e misurare il volume finale dell’estratto.



- Diluire l’estratto 1:60 (100 µl in 6 ml di Acetone) e conservarlo in tubo di vetro avvolto da carta stagnola (soluz. A). Verrà utilizzato per la determinazione spettrofotometrica della concentrazione della clorofilla.

- Lastra TLC: con un righello fare un segno sulla silice a 3 cm dalla base (origine). Tracciare una linea sulla silice a 15 cm dall’origine. Applicare, con l'ausilio di una microsiringa, un’aliquota adeguata dell'estratto dei pigmenti sulla lastra per TLC.



- Sviluppare per 15 cm nell'apposita vasca con miscela di solventi: Esano-Etere dietilico-Acetone = 60-30-20.

- Al termine lasciare asciugare la lastra e localizzare cromaticamente la posizione dei diversi pigmenti sulla lastra. Benchè sia difficile definire esattamente i valori di Rf dei diversi pigmenti, che variano con le condizioni sperimentali, tuttavia l'ordine di separazione e quindi la sequenza dei pigmenti sulla lastra è costante.

Di seguito si riporta la localizzazione cromatica sulla lastra dei principali pigmenti.


Fronte del solvente

giallo

caroteni




grigio

feofitina




blu-verde

clorofilla a




giallo-verde

clorofilla b

.

giallo

xantofille

Origine

verde chiaro

clorofillide a

La feofitina ha la struttura della clorofilla senza l'atomo di Mg, mentre la clorofillide è clorofilla senza il fitolo.

- Se rimane tempo raschiare dalla lastra la silice corrispondente ai diversi pigmenti, trasferirla in tubi di vetro ed eluirla con 2 ml di acetone.

- Centrifugare a 1000 x g per 10 minuti, decantare e ripetere l'operazione di eluizione. Determinare allo spettrofotometro lo spettro di assorbimento dei pigmenti principali nell'intervallo di l : 350-700. In alternativa gli studenti potranno determinare lo spettro dei pigmenti eluiti da una lastra preparata il giorno precedente

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI CLOROFILLA A, B E TOTALE

- Misurare allo spettrofotometro l'assorbanza a 663.6, 652 e 646.6 nm della soluzione A ricordando di azzerare lo strumento con acetone ad ogni lunghezza d’onda.


- Ricordando che il massimo di assorbimento in acetone è 646.6 per la clorofilla b e 663.6 per la clorofilla a, mentre alla lunghezza d'onda di 652 entrambi i pigmenti hanno lo stesso assorbimento, calcolare, utilizzando la legge di Lambert-Beer, la concentrazione delle due clorofille e della clorofilla totale (applicare le formule nei riquadri alla pagina seguente).

A = x C x l

 = coefficiente di estinzione molare

l (elle) = percorso della luce nella cuvetta

C = concentrazione della molecola assorbente

A646.6 = (ea646.6 x l xCa) + (eb646.6 x l x Cb) (1)

A663.6 = (ea663.6 x l x Ca) + (eb663.6 x l xCb) (2)

ea646.6 = coefficiente di estinzione della clorofilla a a 646.6 nm = 20.79 ml cm -1 mg -1

eb646.6 = coefficiente di estinzione della clorofilla b a 646.6 nm = 51.84 ml cm -1 mg -1

ea663.6 = coefficiente di estinzione della clorofilla a a 663.6 nm = 85.95 ml cm -1 mg -1

eb663.6 = coefficiente di estinzione della clorofilla b a 663.6 nm = 10.78 ml cm -1 mg -1

e a b652 = coefficiente di estinzione della clorofilla a b a 652 nm = 34.5 ml cm-1 mg-1

l = 1 cm Ca = concentrazione della clorofilla a (mg ml-1)

Cb = concentrazione della clorofilla b (mg x ml-1)

Risolvendo per Ca nell'equazione 1 e sostituendo nell'equazione 2 si ricava il valore di Cb. Sostituendo il valore di Cb nell'equazione 1 si ottiene il valore di Ca.









V = volume finale dell'estratto in acetone (in ml)

W = peso fresco del tessuto estratto (in g )











In alto: spettro di assorbimento delle clorofille a, b e dei carotenoidi.

In basso: spettro di azione della fotosintesi.


Esercitazione N° 2

Determinazione spettrofotometrica della concentrazione della clorofilla a, b e totale



GRUPPO…………..

Nomi e CdL Risultati


………………………..CdL ….. Concentrazione clorofilla a:


………………………..CdL ….. Concentrazione clorofilla b:
………………………..CdL ….. Concentrazione clorofilla tot:
………………………..CdL …..
………………………..CdL …..

DOMANDE



  1. Perchè è stato aggiunto solfato di magnesi anidro durante l’estrazione dei pigmenti ?



  1. In relazione alle equazioni usate per il calcolo della quantità di clorofilla quale è l’utilità dei coefficienti di assorbimento usati e perchè le letture della densità ottica sono state effettuate a 663.6, 646.6 e 652 nm ?




  1. Perché nell’analisi spettrofotometrica della clorofilla non è necessario sottrarre dall’assorbanza della clorofilla quella dei carotenoidi che pure sono presenti nell’estratto?



  1. Quale differenza vi è tra spettro di assorbimento e spettro di azione e quale è la loro utilità ?



  1. Perché la soluzione di clorofilla cambia colore da verde a rosso, quando è colpita da un raggio luminoso al buio?


  1. Come si spiega la separazione dei pigmenti tramite TLC?


  1. Quali lunghezze d’onda e quali colori assorbono maggiormente i diversi pigmenti fotosintetici ?








©astratto.info 2017
invia messaggio

    Pagina principale