Solo 16 ore il corso da' per scontato biologia molecolare e cellulare



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BIOCHIMICA CLINICA
6 MARZO

solo 16 ore.

il corso da' per scontato biologia molecolare e cellulare.

Lei tratta le tecniche di biologia molecolare: sono importanti per applicazioni diagnostiche.

mette su dir.
ESAME

scritto. 30 domande a risposta multipla, solo 1 è corretta. il voto fa media con gariglio e bellomo.


LA GENOMICA IN ONCOLOGIA

slide obbiettivi diagnostici in oncologia

ci introduce ciò di cui parleremo. ora cominciamo con le tecniche di base, poi accenniamo le tecniche genomiche che sono più complesse.
parliamo di genomica: ha rivoluzionato il modo di fare medicina.

la scoperta in bio mol che ha rivoluzionato il modo di curare il paziente? il sequenziamo del DNA: è avvenuto nel 2003, da qui la bio mol ha fatto salti in avanti incredibili, accompagnati da una rivoluzione tecnologica incredibile; son cambiate proprio le mdoalità per curare i pazienti e lavorare in lab, proprio grazie al sequenziamento del DNA.

perchè noi ora conosciamo tutte le basi del nostro DNA: oggi noi dobbiamo solo capire la funzione di queste basi del dna. grazie a questo, sappiamo che la nostra sequenza di dna è identica tra gli umini, eccetto piccole modifiche di base che rappresentano i POLIMORMIFSMI del DNA.

la sequnziamento ha cambiato la maniera di: sdlide --> è iniziata la medicina personalizzata = molecolare; oggi noi possiamo assegnare una terapia personalizzata i polimorfismi.

dopo il 2003, sono nati i CHIP: sono strumenti piccoli presenti in cell, pc ecc; hanno permesso l'analisi di tanti campioni contemporaneamente e in tempi molto veloci.
slide la biologia moderna: PROGETTO GENOMA

si chiamama human genome project. è nato intorno agli anni 90: scienxziati si sono seduti e hanno deciso di collaborare mettendo in comune soldi. il loro scopo è sequenziare il genoma umano. hanno deciso la tecnica di sequenziamento, e si sono prefissati 10 anni: li hanno impiegati tutti. la prima versione del sequenziamento è stata pubblicata negli annni 2000, la versione completa è stata pubblicata nel 2003.

inghilterra, usa, italia (ha partecipato allinizio, dopo 2 anni si è tolta. quindi non ha parteciupato al sequenziamento): sono i paesi che hanno partecipato, ci sono voluti moltissimi soldi.

quali sono stati i principali risultati del sequenziamento del DNA?

slide avena sativa

'non siamo gli essere più complessi': prima dle sequenziamento gli scienziati pensavano ch eil livello evolutivo degli organismi fosse proporzionale al numero di geni. questo non è vero. vediamo che le piante hanno più geni di noi, i roditori lo stesso di noi.


gli umani sono uguali per il 99%; ll'1% rappresenta i polimorfismi.
lside organizazzione del genoma umano

il sequenziamneto ci ha permesso di stab la porzione cod, non cod (es mirna), sequenze ripetitive, pseudogeni.


slide era posto genomica

dopo il sequenziamento del dna simao entrati nel: era post-genomica.

viviamo nell'era post-genomica: applichiamo il sequenziamento del DNA; noi quindi ora impariamo le tecniche di POST-GENMOMICA: sono le tecniche nate dopo il sequenziamento del DNA.

è nata:


1) GENOMICA FUNZIONALE:

è una genomica che viene applicata per lo studio della funzione dei geni. con il sequenziamento conosciamo si la sequenza del DNA di ogni persona, oggi però dobbiamo ancora attibuire una funzione a tutit i pezzi di DNA. la gen fun si serve di ingegneria genetica (dobbiamo esprimere in celule dei geni, dobbiamo usare la RNA interference per eliminare la fuznone del gene all'interno della cellula per capire che funzione ha quelal parte di DNA), della trascrittomica (è nata la mrna sequencing, misurazione dei livelli di mRNA. studia quindi i trascritti=l'espressione genica), la nextgeneration sequencing (dono le tecniche per sequenziare. sanger: è la tencica usata nel anno 2000; oggi si usa invece tecniche di nextgeneration, ne parleremo), proteomica (studia le proteine; ad esempio il western blot studia la proteina all'interno della cellula; poi ci sono tenciche + complesse).

2) SYSTEM BIOLOGY:

sono nati dei bioinformatici : sono medici biologiic, devono analizzare tutti i dati che emergono dal sequenziamento, dalla proteamica, trascrittomica. prima si studiava un singolo gene e proteine, oggi invece si studiano tutte le proteine, tutti gli mrna della cellula: quindi abbiamo un sacco di dati che vanno interpretati, ed è il bioinformatico che li interpreta.


con l'avvento dell'era post-genomica: le varie figure devono interagire e lavorare insieme in equipe (es medico, fisico, biologo ecc).
lei ci parla anche dei dettagli, ma noi dobbiamo sapere i concetti generali.
3) tutte queste tecniche di genomica si usano in FARMACOGENOMICA E TERAPIE PERSONALIZZATE:

ne parleremo se c'è tempo.


ora iniziamo LE TECNICHE GENOMICHE

slide nuove disciplice della genomica funzionale

-INGEGNERIA GENETICA: legge tutta slide. ne parleremo.
slide analisi del DNA

cominciamo a vedere l'analisi del DNA.

acidi nucleici: DNA, RNA --> studiam dna o rna.

tappe:


1)isolare gli aciidi nucleici. dobbiamo decidere se partiamo da tessuto, o da uan coltura cellulare.

dobbiamo anche saper isolare il dna plasmidico (nei procarioti abbiamo un dna cromosomico + dna a doppia catena circolare nel citosol del batterio detto plasmide): se vogliamo studiare un gene, dobbiamo clonarlo in un vettore (parleremo di clonaggio), e il vettore epr clonare sono vettori plasmidici.

2)analizzare gli aciid nu: dna o rna.

3)sapere la conc: dobbiamo usare tecniche spettrofometro.

4)separare gli acidi nucleici: mediante elettroforesi, per separare dna o rna.
vediamo ora queste tappe.
1)ISOLAMENTO

partiamo da tessuto animali, o vegeatli, o sangue slide.

da questo campioni biolgici, dobbiamo estrarre l'acido nucleico: in medicina legale dobbiamo estarrre dna dal sangue, successivamente si fa una PCR grazie alla quale amplifichiamo (es diagnosi di paternità, maternità, di colpevolezza).

poi usiamo enzimi di restrizione, elettroforesi, clonare il DNA, poi PCR, e poi sequenziare e analizzare dal punto di visto bioinformatico.


slide varie fonti

l'acido nucleido: nel nucleo del euc, nel citosol nel proc (anche plasmide).

prima di tutto dobbiamo lisare la cellulare: perchè noi sappiamo che acido nuc si trova all'interno della cellula:

-nel batterio: distruggiamo aprete cell, membrana cellulare.

esistono quindi tecniche di lisi cellulare.
slide batteriifagoi

il dna è una struttura stabile, di facile manipolazione, può essere conservato a 4 gradi.

RNA: rispetto all dna, è una sturttura molto + labvile, si degrada facilmente. la nostra cute è ricca di rnasi e dnasi: questi degradano RNA, quindi per isolare del RNA dobbiamo usare guanti e neutralizzare le rnasi; per il dna invece possiamo anche non usare i guanti perchè il dna è più resistente e quindi è più accessibile. rnasi degrada molto facilmente.

se dobbiamo isolare rna: (vetreria sterile)

1)disinfettiamo

2)usiamo acqua clavata che inattibva le proteasi

3)nmette guanti

quindi per estarrre rna si seguono accorgimenti maggiori.


rna è stabile se conservato a -70 c° (se no rna si degrada); dna possiamo tenerlo anche a T ambiente.
slide strazione acidi nucleiic

legge


tutto signfiica che: se vcoglio estrarre dna da es un fegato (quindi è un tessuto), oppure ho coltivato delle cellule in laboratorio e voglio estrarre dna da queste --> nei 2 casi la tecnica è diversa.

tessuto: lo devo disgregare per arrivare i nuclei, è + complesso; devo eliminare il connettivo, fino al nucleo. il tessuto cartilagineo è più consistente di un cervello (che è più molle), quindi la difficoltà varia.

coltura: qui devo solo lisare la m plasmatica. quindi qui devo solo decidere quale soluzione usare per lisare la m plasmatica e poi quelal nucleare, di modo che esca il DNA.
slide le nucleasi

noi vogliamo ottenere un DNA O RNA PURO, quindi non degradato.



cosa vuol dire non degradato? (dire poche le poche cose che sappiamo in modo scientifico)

come si coltiva: una fiaschetta di plastica in cui pipettiamo le cellule; io voglio estrarre l'acido nucleico esatatmente com'è contenuto all'interno, non si deve modificare; per fare questo io le cellule io le pelletto, le centrifugo.

le leucemie crescono in sospensione, io metto il contenuto della fiaschetta in un falcon; centrifugo il falcon cosi le celluel sedimentano nel falcon.

non degradato: cioè il dna deve essere integro, e NON frammentanto in tanti piccoli pezzi (questo signfiica degradato).


dop l'estrazione, dobbiamo anche saper dire se è integro (cioè non è frammentato).

poi noi possiamo decidere di degradarlo: mediante ENZIMI DI RESTRIZIONE, che digeriscono il dna frammentando; però quando lo estraiamo deve sempre essere integro.


sulla cute abbiamo quindi le NUCLEASI: dnasi e rnasi.

esame: 'asi' indica le proteine che tagliano.

-ENDOnucleasi: taglia all'interno della catena

-ESOnucleasi: esterno

sono entrambe nucleasi.

noi mettimao i guanti cosi le NOASTRE rnasi non spezzano il rna che voglio estrarre.


autoclave: significa mettere tutto ciò che utilizziamo (soluzioni, punte della pipetta ecc) deve essere autoclavato, per eliminare queste nucleasi.
slide estrazione di acid nucleii

sia dna che rna.

1)LISI CELLULARE

2)DEPROTEINIZZAZIONE

quando estraiamo acido nucleico, insieme a questo dalla cellula si liberano anche proteine. noi vogliamo l'acido nucleico puro, quindi dobbiamo eliminare le proteine.

acido nucleico si trova in sospensione: noi dobbiamo PRECIPITARLO; poi lo risponsendiamo con H2O o..


slide LISI CELLULARE

come le lisiamo?

1)LISI AGGRESSIVA

2)PIU DELICATA:

la lisi non deve essere troppo aggressiva perchè vogliamo che acido resti integro.
le tenciche di lisi:

1)distruzione meccanica: lo possimao fare emdiante lisi ipotonica

2)chimici: con dei detergenti

3)digestione enzimatica: con enzimi


slide ROTTURA DELEL CELLULE

legge.


1)metodi meccanici:

a)usano degli omogheneizzatori: sono centrifughe

b)oppure ultrasuoni: mettimao la provetta sulla sonda del sonicatore, e gli ultrasuoni lisano la m celulare.
2)non mecc:

a)se congelo la provetta, e poi la tolgo dal ghiacco: lo ripeto molte volte, in questo mdo rompo el cellule.

legge
slide MEZZO PER L'OMOGENEIZZAZIONE

1)usiamo una soluzione isotonica (non sapere composizione).

sapere EDTA e DTT.

EDTA: agente chelante, chje quando è prsente nelel solizioni di lisi serve a preservare sturttura cellula e inibsice le dnasi.

DTT e BME: riduce i ponti di solfuro, sono gli agenti riducenti utilizzati (esame). sono usati nelal preparazione dei campioni.
slide dounce

legge


1)DOUNCE: dentro metto il fegato, poi il pistone si usa muovendolo in alto-basso fino a ridurre in poltiglia il fegato. a seconda del tessuto da omogenizzare, i tempi varinao in base alal consistenza del tessuto. dounce è uysato per lisare tessuti e non cellule.

2)POTTER: si muove elettricamente, e non a mano. il concetto è lo stesso: ridurre un TESSUTO in qualcosa di meno consistente.


slide SONICATORI:

serve per lisare sia tessuti, che frammentare il DNA.

la sonda del sonicatore emette ultrasuoni: questi ultrasuoni lisano il tessuto, oppure se abbiamo il dna isolato questo viene frammentato.

infatti per le tecniche di asequenziamento di ultima generazione il dna va frammentato, e lo si effettua mediante ultrasuoni.


METODI NON MECCANICI

si usano epr le celluel.

1)se sono in coltura in sospensione: devo centrifugurare e usare unnpellet.

2)se la coltura è aderente, tolgo il liquido e le celluel restano aderenti.


devo scegliere il buffer di lisi:

1)a volte non voglio distruggere totalmente la m nucleare.

il tmapone contiene:

a)dteergrenti: rompono la m cellula rompendo lipidi e dissocianod le proteine dagli aciid nucleici.

i detergenti sono:

-p40: è molto forte già con 1%

-tween 20 : effettua una lisi più modesta, si distrugge di menolegge.

-SDS è contenuto nella normale saponetta: distrugge tutte le membrane, resta solo acido nucleico.

b)enzimi

possiamo usare inibitori di proteasi, oppure proteinasi K che degrada le proteine di membrana. legge


la lisi può essere:

1)blanda: la m cromosomiale resta attaccata alla m interna. 1.06

2)spinta: per averla usiamo SDS. la usiamo per isolare: dna cromosomiale ecc. slide.
slide estrazione di aciid nucleici

DEPROTEINIZZAZIONE

l'estrazione legge

l'allontamento del m si fa con centrifugazione: sono detriti più pensati e si depositano, sulla parte sup della provetta restano acidi nucleiid e proteine.

3)usiamo il fenolo per eliminare proteine e lipidi e carboidrato.

fenolo è mutageno: quindi va usato e smaltito con attenzione.

4)dobbiamo allontanare il fenolo utilizzato, grazie al cloroforbio

5)ora dobbiamo precipitare l'acido nucleido: è fatto con alcol e sodio acetato.

6)dobbiamo dosare l'acido nucleico
slide 2)ALLONTAMENTO DELLE M

centrifugando: questo che precipita è pelleto (m + frammenti cellulari).


slide centrifugazione

legge
slide deporteinizzazione

il nostro pellet contiene anche acido nucleico + il resto.

per eliminare leproteine, aggiungiamo fenolo.


slide allontanamento peoteine

legge metodo.

dobbiamo risospdenere il pellet.

aggiungiamo fenolo, e la soluzione diventa lattescente (basta scuotere con le mani). ora centrifughiamo [mettiamo la provetta o l'eppendolf (provette piccole) o falcon (provette più grandi) nel macchinario. a seconda del pm i vari cosrtituenti si tratificano, anche a seconda della loro solubilità]: avremo di nuovo pellet, e poi avremo una stratificazione (slide 3 fasi).

fenolo è pesante e si deposita nel fondo.

le proteine subito sopra (precipitato di proteine)

3)dna o rna si stratificano nelal 'fase acquosa'.

ora con una pipetta io prelevo SOLO la parte acquosa che contiene DNA O RNA: li trasferisco in una provetta nuova. in questa manierta HO ISOLATO DNA O RNA, NON PRENDO LE PROTEINE.


esame: come si fa la deproteinizzazione? usando fenolo, con una quantità 1:1 : cioè uso un vol di fenolo uguale al volume di lisi che ho. es ho un vol di 500 microlitri, agg 500 microlitri di fenolo.
1 ml= mille microlitri.

quando parliamo di celluel, parliamo di microlitri.


slide ESTRAZIONE FENOLICA

quando recuperiamo la fase acquosa: non è facile, perchè con la punta non dobbiamo toccare il precipitato di proteine; se no contaminiamo il dna con le proteine. se è contaminato, no può essere sequenziato con facilità.

inoltre rischio di protarmi dietro anche fenolo: nel caso, per togliere il fenolo faccio dei lavaggi con alcol isoanilico del ugual volume di fenolo che mi ha contaminato -->è estrazione eterea (slide). è quindi una procedura isata per eliminare il fenolo che ha contaminato l'acido nucleico che vogliamo isolare.
slide 5)ALLONTANAMENTO DI DNA O RNA

finora la procedura per DNA e RNA era la stessa.

ora: agg rnasi per eliminare rna e avere solo dna, e vice (dnasi).
slide PRECIPITAZIONE

ora abbiamo es DNA in H2O nella nostra provetta o in un tampone.

ora voglio rispondere dna in un vol che decidiamo noi.

es gli addetti del sequenziamento vogliono: 1 microrgammo di DNA in 20 microlitri in un ependolf.

cosa faccuio? prima precipito dna (si usa 2 vol di entaolo. dna in 500 microlitri, agg 1 ml di etanolo. e poi aggiungo sodio acetato 0,3 M in una soluzione finale di 0,3 M. ora centrifugo, e ho un pellet che contiene acido nucleico. se voglio eliminare l'eventuale sodio acetato faccio un lavaggio con etanolo al 70 %. non le interessano questi dettagli: le tappe, come si precipita cioè etanolo e sodio acetato), e poi lo risospendo enl vol che volgio.
se centrifugo, capovoglo: il liquido va via, e mi retsa il pellet.

ora il pellet lo devo rispondenre.


il dna in sospensione appare come un fiocco di neve (slide, dna in viola); è visibile macroscopicamente.
7)DOSAGGIO

ora che ho isolato dna, devo sapere la concentrazione del DNA.


salta un sacco si dlie. arriva a spettrofotometro.

la conc si stabilisce usando l spettrofotometro.

nelle pipette mettimao la soluzione che contiene il DNA.

otteniamo spettri di assorbimenti dei nucleotidi: si usa una luce ultravioletta a lunghezza d'oinda di 260 nm; poi calcoliamo la densità ottica a 260 nm e 280: se il rapporto tra le OD misurare a queste lunghezze d'inda è tra 1,8-2 dice che dna è puro (non contaminato da fenolo e proteine); se no è stato contaminato.

dall'assorbanza: otteniamo i microgrammi di NDA per mll, perchè sappiamo che 1 OD=slide.

15 MARZO


Side ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

1 ml=1000 microlitri.

In lab usiamo gilson che sono pipette, in cui ci sono piccole punte, che pipano microlitri (100, 200…).

Io devo purificare il DNA perché lo voglio usare per fare altre tecniche, quali una PCR. Io devo sequenziare il DNA per poter verificare se vi è una mutazione.

Il DNA lo risospendiamo nel volume che vogliamo (es in 10,20 microlitri ecc) a seconda dell’utilizzo che ne dobbiamo fare.

Per precipitare l’acido nucleico: si usa etanolo e sodio acetato, ma è sufficiente anche solo l’etanolo.

Dopo la precipitazione, si forma il fiocco di DNA; successivamente dobbiamo centrifugare cosi il fiocco resta attaccato alla provetta e il resto del liquido lo eliminiamo. Potrei fare un ulteriore lavaggio con etanolo al 70% per purificare a soluzione da Sali.
NUOVE SLIDES – ELETTROFORESI DEL DNA

S,ide gel di agarosio

Fin’ora noi abbiamo estratto il DNA, ora ci interessa:

-la sua conentrazione: usiamo lo spettrofotometro. Alla luce il dna ha uno spetro di assorbimento alle lunghezze donda di 260-290 nm, noi sappiamo che un OD corrisponde a un tot di mg di DNA e cosi risaliamo alla conentrazione.

Ci permette anche di sapere se il dna è contaminato da proteine o fenolo: rivedi il rapporto.
Noi vogliamo sequenziare il DNA: prima di far questo dobbiamo clonare il DNA.

Per poterlo clonare,dobbiamo vedere se il dna è degradato, integro, digerito ecc  dobbiamo fare un elettroforesi del DNA.


Ll’elet usa il gel di agarosio.

Dna è una molecola carica neg, quindi in un campo elettrico migra verso il polo pos: noi facciamo proprio questo.

Elet sfrutta quindi un campo elettrico e una differenza di potenziale. Elet presenta un alimentatore che genera una differenza di potenziale, e cioè i 2 poli; poi serve un supporto che è il gel agarosio.

La velocitò di migrazione dle dna dipende da:

-forma: se è lineare, se è digerito ecc migra diversamente

-rapporto carica-massa: la magg parte delle molcole di dna hanno la stesa forma e hanno rapporti carica -massa molto simili. Quindi elet separa il dna sulla base delle dimensioni del dna: cioè i frammenti con PM maggiore migreranno più lentamente (quindi saranno più vicini ai pozzetti dove abbiao caricato i nostri frammenti di DNA), i più piccoli più velocemente.


Slide catodo anodo

Rappresenta una camera di elet.

Se usiamo gel di agarosio, elet è orizzontale; se usassimo poliacrimmide sarebbe verticale.

Noi possiamo decidere si usare agarosio o poliaccrmide: entrambi contengono pori slide.

La poli ha una matrice diversa, serve a discriminare i frammenti piccoli: es se ho frammenti intorno a 100 basi, decidiamo di usare un gel di poli.

Agarosio è molto più maneggevole, sono più comunemente usati. Servono per discriminare frammenti più grandi.


Agarosio è una polvere, viene messo dentro una beuta, ci aggiungiamo un tampone: poi nel microonde di sciolgono. Quando è sciolto viene versato in una vaschetta e bisogna attendere che il gel si solidifichi.

Stessa cosa vale per poli.


FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITà

-dimensioni del DNA: che è inversamente porpo-

-concentrazione dell’agarosio: Più agarosio è spesso (e quindi la % è maggiore), più è utile a discriminare dei frammenti piccoli (intorno a 200-300 bs). La concentrazione più bassa usata è 0,8%. Attenzione che se la concentrazione è troppo bassa, il gel è più molle ed è più facile che si frammenti, quindi è poco maneggevole; se la concentrazione è maggiore invece il gel è più duro e maneggevole. Si dice proprio ‘molle’ ‘duro’.

Se il gel è troppo duro: il dna è attratto dal polo positivo, però ci sono le matrici dell’agarosio che sono talmente strette che ostacolano un po la migrazione del dna.


K varia la variare della concentrazione di agarosio nel gel.

-conformazione: il plasmide è un vettore usato per il clonaggio. A seconda che il dna sia superavvolto, lineare, parzialmente denaturato (conformazione) ecc migrano diversamente.

-voltaggio: lo decidiamo noi. Dipende dai nostri tempi: se vogliamo una corsa lenta, o più rapida  applichiamo un voltaggio diverso.

-composizione del tampone di corsa: si usano soluzioni tampone per sciogliere l’agarosio; queste sono TBE o TAE.


Agarosio è bagnato da un tampone dopo che si è solidificato.

Io ho il mio DNA sospeso in H2O nella mia provetta. Come faccio a mettere il dna nel pozzetto, se abbiamo 2 liquidi (del mio dna e il tampone)? Io voglio che il DNA resti localizzato dove lo metto, mentre solitamente liquido su liquido diffonde.

Per risolvere, il DNA deve essere caricato LOADING BUFFER/tampone di caricamento: contiene


  • glicerolo (è pesante e quindi fa si che il dna vada nel fondo del pozzetto),

  • e 2 coloranti (blu di bromoferolo e colx) perché ho bisogno di vedere/seguire come avviene la corsa.

Il blu di bro migra come migra un frammento di 300, cloro di 4 mila.

A seconda di dove vedo il blu e il verde, io vedo dove è arrivato il mio dna: se voglio identificare quello di 300 e non vedo più blu, significa che i frammenti di 300 sono usciti dal gel (questo significa che l’ho perso, io devo stare attenta a spegnere l’alimentatore quando voglio, se no il dna continua a migrare).

CONFORMAZIONE DEL DNA

La forma super avvolta corre più velocemente, lineare un po meno, circolare un po’ meno.


Io voglio vedere il dna, quindi uso un colorante fluorescente bromuro di etidio che ha la proprietà di intercalarsi nel DNA (e anche un pochino nel gel di agarosio). È mutageno, quindi questo gel va sempre maneggiato con guanti.

Questo colorante emette una fluorescenza quando mettiamo il gel al transillumintatore (cioo ai raggi uv): facciamo una fotografia con la polariodi, la slide in blu ce la mostra, e vediamo i vari frammenti del DNA  per conoscerne le dimensioni usiamo un marcatore del DNA detto DNA ladder che è una scala con dimensioni note: lo confronto con i miei frammenti.

Leggi slide caricamento del gel.
Fase precedente:

Quando mettiamo il gel (agarosio) liquido, mettiamo un pettine, e poi facciamo solidificare. Cosi quando tolgo il pettine mi si formano questi pozzetti.


EITIDO BROMURO: colora il DNA, visualizzata con UV.
La colorazione con etidio si fa alla fine!!! Prima per vedere il dna usiamo i 2 coloranti citati prima: sono coloranti che carichiamo in tutti i campioni di dna.

Io so che un frammento blu corre come un frammento di 300 basi.

Questi 2 coloranti NON si integrano nel DNA: ma es il colorante blu migra come migrerebbe un frammento di 300 basi, e cosi mi faccio n’idea di a che punto sono arrivata.
Quando coloro con etidio brom, questo andrà a colorare anche i marcatori di dimensione ch eho inserito come riferimento per la capire la misura dei frammenti che ho.
Vedi slide preparazione del gel di agarosio.
Salta slide f e apre slide nuove CLONAGGIO

Clonare: significa fare tante copie identiche.

Noi parliamo del clonaggio di un tratto di DNA che contiene un gene.

Per clonare richiede procedimenti:

1)la sequenza che voglio clonare (in verde) deve essere inserita in una vettore (in blu).

2)devo inserire il vettore in una cellula capace di amplificarlo: perché ne voglio ottenere tante. È il processo di TRASFROMAZIONE. Noi lo inseriamo in batteri, in particolare e coli.

3)poi devo selezionare le cellule che contengono il vettore con l’inserto

4)devo far proliferare le cellule trasformate.


LIGASI

Il vettore è detto anche costrutto.

DNA RICOMBINANTE: cos’è? (esame) è la tecnologia che mi permette di ottenere una molecola di dna modificata.
Per inserire la sequenza nel vettore, io devo tagliare il vettore.

Il vettore più comunemente usato è il plasmide, e il plasmide è una molecola di dna circolare chiusa: io devo tagliarlo e aprirlo per inserire la mia sequenza verde.

A questo punto devo ligare la sequenza verde, e poi favorisco la chiusura del plasmide.

Per tagliare il vettore usiamo ENZIMI DI RESTRIZIONE.

Dobbiamo anche preparare l’inserto.

A questo punto, dobbiamo usare una LIGASI che inserisce la sequenza verde nel vettore aperto: OTTENIAMO UNA MOLECOLA DI DNA NUOVA (VETTORE + SEQUENZA VERDE) DETTA DNA RICOMBINANTE.


L’enzima di restrizione va usato per tagliare anche la sequenza di DNA di interesse.

Enzima di restrizione è una proteina capace di tagliare il DNA.

Enzimi di est riconoscono SOLO sequenza specifiche del DNA, in cui vanno a tagliare: es ecor1 taglia solo il sito GAAATCC.

Questi enzimi sono stati identificati nei procarioti, e si chiamano di restrizione perché la loro funzione sembra essere quella di proteggere il batterio da infezioni di virus, cioè da dna estraneo che vinee introdotto all’interno del batterio; il batterio ha quindi dentro questi enzimi (che possono essere di tipo 1,2,3: alcuni sono anche metilasi, quelli che usiamo noi no. Leggi slide enzimi di restrizione. Noi usiamo il tipo 2).

Per avere estremità compatibili di vettore e sequenza verde: li devo tagliare con LO STESSO ENZIMA DI RESITRIZIONE, cosi la ligasi poi riesce a legarli.

Le sequenza riconosciute dai restrizione sono sequenze di 4,6,8 nucleotidi e sono spesso palindromi.

Gli enzimi di restrizione vanno comprati.

L’attività dei restrizione si misura in ‘unità di enzima’.

L’enzima di restrizione va messo in frigo a meno 20; se l’operatore lascia l’enzima di restrizione a temperatura ambiente, questo non funziona più.

Insieme all’enzima di restrizione si vende anche un buffer/tampone specifico per l’enzima di restrizione.

Il buffer è espresso come ‘10 per’: significa che devo diluirlo 10 volte.
ENZIMI DI RESTRIZIONE

Ne vediamo 3 esempi.

Non tutti gli enzimi di restrizione producono lo stesso tagio.

-SMA1: tagia al centro di CCCGGG. Sono i più difficili da usare

-ECOR1: tagliano le estremità sporgenti 5’. Sono gli enzimi più facile per clonare.

-PSTL: ‘’’ 3’. Come difficoltò sono intermedi.


PJAM: è un vettore plasmidico dei più comuni.

La ligasi ricostituisce legami fosfodiesterici tra 3’ e il fosfato al 5’, di molecole di dna adiacenti. La ligasi funziona SOLO se è presente ATP.

Nella prima reazione ligasi slide
Il buffer della ligasi è delicato perché contiene ATP!! Gli altri buffer invece possono stare anche a temperatura ambiente.
La DNA ligasi più utilizzata è quella codificata dal batteriofago T4.
FOSTAFATASI ALCALINA

Legare la sequenza al vettore non è semplice.

Abbiamo il vettore , lo tagliamo con ECOR1.

NOI NON VOGLIAMO PERDERE NESSUNA SEQUENZA DLE VETTORE: quindi deve esistere SOLO 1 sequenza per ECOR1, perché se no mi farebbe 2 tagli e perderei un pezzo.

Se ne esiste solo 1, abbiamo solo 1 taglio, il vettore si apre e non perdo niente.

La ligasi può far richiudere il vettore senza la mia sequenza verde (perché il vettore presenta le estremità che sono complementari), non ha un cervello; per evitare questo devo defosforilare il vettore, tolgo il fosfato sufficiente affinché avvenga la ligazione  lo faccio usando la fosfatasi alcalina.


Il vettore senza fosfato, può comunque ligare la sequenza verde al vettore, perché la sequenza verde contiene un fosfato.
Salta e raggufe I VETTORI

I vettori sono scelti in base alle dimensioni della sequenza verde.

-Se usiamo plasmidi: la sequenza verde deve avere dimensioni comprese tra 0,1 e 10 kb. Leggi slide.

-fagi: ora sono più usati, perché servono ad esprimere dei geni in cellule primarie (es cellule staminali), dove non è possibile utilizzare vettori plasmidici, perché sono difficili da maneggiare.

-COSMIDI

BAC


Gli utlimi 3 sono usati solo raramente e si usano per dimensioni di sequenze molto grandi.
PLASMIDI

Contengono:

-Presentano la sequenza ORI: sequenza di origine di replicazione che permette al plasmide di potersi replicare in maniera autonoma all’interno della cellula in cui io metto il plasmide.

-MCS: è un pezzo di dna che contiene quei siti di restrizione per gli enzimi di restrizione che sono UNICI. Es ha la sequenza riconosciuta da ecor1, o da sma ecc. è proprio grazie alla presenza di questi siti che possono ottenere un dna ricombinante.

-DNA esogeno. È la sequenza verde

-una sequenza codificante per un gene che slide. Es contiene il gene per la resistenza all’ampicillina. Quindi noi facciamo crescere i batteri in terreni contenenti ampicillina: i batteri col plasmidi sono resis6enti e formeranno colonie, i batteri senza questo plasmide non sono resistenti a ampicillina e dunque moriranno.


VANTAGGIO DEL PLASMIDI:

-più mangevveol perhcè è più piccolo

-è più facile da estrarre dal batterio (e poi metterlo in una cellula eucariotica), cioè isolarlo dal cromosoma batterico.

-è più facile da inserire all’interno in un batterio. Più il plasmide è grosso più è difficile da introdurre nei batteri.


TRASFROMAZIONE

Noi abbaimo prodotto la moleocle ricombinante.

Ora faccimao la trasfromazione: cioè trasferiamo un dna esogeno in c

Se lo inseriamo in cellule eucariotiche diciamo trasfezione. Slide.

Attenzione che lo stesso termine ‘trasformazione’ può riferirsi a un processo diverso.
Leggi tutta slide.
Usiamo Cacl perché interferisce con parete e membrana batterica, perché noi vogliamo che il dna esogeno possa superare le pareti dei batteri, entrare nel suo citosol e replicarsi.

Cacl forma dei por.

Oppure possiamo fare uno shock termico (è l’elettroporazione): portiamo le cellule da ghiaccio secco a 37°, e questo permette anche al dna di penetrare nella cellula batterica.

Cuvette: usate per trasfromazione i batteri mediante elettroporazione.


SELEZIONE

Nella piastra possiamo avere diversi risultati:

-batteri vuori: in cui nn è penetrato il dna ricombiante

-batteri che hanno solo il vettore

-batteri che hanno vettore legato all’inserto.
Se facciamo crescere batteri in terreno contenente un l’antibiotico come metodo di selezione, quali classe discriminiamo?

Morira: batterio vuoro. Gli altri 2 portano il gene di resistenza per ampiliccina e quindi sopravvivono.

Però a questo punto non riusciamo a discriminare tra tipo 2 e 3: per farlo facciamo crescere in maniera separata el colonie, e poi riandiamo a isolare il dna da queste colonie, digeriamo di nuovo il dna con l’enzima di restrizione, e vedimao se mi fa ottenere il vettore separato dall’inserto (se avviene , ho vettore più inserto; se no ho solo il vettore. Per visualizzare si usa un elettroforesi).
Come discriminiamo i tipi 2 e 3?

Lo possiamo fare perché noi usiamo vettori con un promotore lac: regola la trascrizione, produzione di beta gallatositasi.

Se questo promotore funzione produciamo la beta galat.

Se aggiungiamo un substrato cromogenico come xgal, in presenza di beta galat, la betgal metabolizza questo colorante e quindi vedremo le colonie colorate di blu (perchè il colorante precipita a causa di beta galat).

Il gene esogeno che abbiamo clonato, va a spaccare la beta galat: quindi quando aggiungiamo beta gala, xgal non precipita più e quindi le colonie saranno bianche.

Quindi le colonie con vettore+inserto appariranno bianche, le colonie con solo il vettore appariranno blu.


20 MARZO

LA PCR
PCR è una tecnica di clonaggio in vitro. Clonare significa ‘REPLICARE’ : quindi produciamo grandi quantità di specifici frammenti di DNA.

Chi ha scoperto questa tecnica della PCR ha avuto il nobel: è Kary Mullis nel 1993.

Noi da poche molecole di DNA possiamo ottenere una grande quantità di molecole; possiamo amplificare uno specifico frammento di DNA. Noi replichiamo un frammento di DNA perché poi vogliamo: sequenziarlo, oppure vogliamo clonarlo in un vettore (ne devo avere tante copie per farlo).


Oggi vediamo come funziona la PCR.
La PCR è:

  • un’amplificazione esponenziale di DNA (poi spieghiamo cosa intendiamo per esponenziale)

La PCR puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

  • Permette di “estrarre” un piccolo frammento specifico di DNA dall’intero contesto in cui è immerso

  • È di semplice realizzazione: cioè è una tecnica facile; infatti in generale bisogna anche far in modo che le nuove tecniche che vengono inventate siano maneggevoli, cioè che possano essere utilizzate dalla maggior parte delle persone e che non siano costose  se no non vengono utilizzate.

  • Estrema versatilità

ELEMENTI DELLA REAZIONE IN VITRO (IN ANALOGIA AL PROCESSO DELLA DUPLICAZIONE DEL DNA):

Una differenza fondamentale tra RNA pol e DNA pol è:


  • la DNA POL: ha bisogno di un primer, se no non riesce a duplicare il DNA. Inoltre ricorda che abbiamo 2 filamenti di DNA nella doppia elica, quindi avremo che un filamento viene replicato in direzione 3’- 5’ e uno in direzione 5’-3’ (parliamo di filamento veloce e lento). Ricorda che il primer (un primer è una sequenza di innesco: cioè serve per poter iniziare/innescare la polimerizzazione. Infatti possiamo chiamarlo PRIMER o INNESCO) per la DNApol è un RNA: infatti la dna pol possiede anche un’attività per eliminare questo innesco di RNA (perché il filamento che viene polimerizzato dalla DNApol NON deve contenere RNA!) (ripassa queste cose).

  • La RNA pol: non ha bisogno di un primer. Cerca direttamente il promotore del gene (quindi parliamo di DNA), e inizia a polimerizzare direttamente producendo RNA.

Come si fa la PCR:

1)mettiamo lo stampo (ESAME): viene chiamato anche TEMPLATE (detto anche templato in italiano). È il DNA che noi vogliamo amplificare, che contiene al suo interno la sequenza di DNA vogliamo clonare/replicare/amplificare.

2)abbiamo bisogno di una DNApol: che ha una caratteristica in più rispetto alla DNA pol che agisce nelle nostre cellule. Questa deve essere TERMOSTABILE: cioè deve resistere e non perdere la sua attività enzimatica/polimerizzare il dna, a temperature molto alte (parliamo di 95°): questo perché nella PCR abbiamo una fase di denaturazione del DNA, e la denaturazione viene effettuata con temperature molto alte.

Nella nostra provetta, che usiamo per fare la PCR: noi stiamo subito mettendo tutti i nostri reagenti (tutti questi nostri reagenti formano un MIX), infatti mica mettiamo la DNA pol solo dopo aver denaturato il DNA (nel senso metto la DNApol dopo per evitare che il DNA venga denaturato all’alta T che usiamo per denaturare il DNA): noi facciamo subito il mix, e poi modifichiamo le temperature (quindi questo mix si subirà diverse temperature); quindi questa DNApol deve essere in grado di resistere alle alte temperature per la successiva fase di denaturazione.
3)dobbiamo aggiungere i DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI.

I desossinucleotidi sono i nostri mattoncini, usati dalla DNApol per polimerizzare. Mettiamo tutti e 4 i desossinucleotidi. Usiamo desossinucleotidi perché amplfichiamo DNA (e non RNA). Questi desossinucleotidi devono essere TRIFOSFATI: infatti senza P non può essere sintetizzato un filamento di DNA.


4)serve un BUFFER/TAMPONE: che contiene Mg. Perché Mg è il cofattore principale delle polimerasi. A volte non riusciamo ad amplificare il tratto che vogliamo perché la nostra PCR non funziona; il problema potrebbe essere la concentrazione di Mg del nostro buffer, quindi iniziamo a modificare la quantità di Mg presente nel buffer fino a che non riusciamo a far avviare la reazione di PCR.
5)la rna pol cerca il promotore, non ha bisogno del primer.

La dna pol invece NON può produrre un filamento di dna senza un innesco/PRIMER.

Guarda slide giù.

Quindi noi dobbiamo disegnare 2 OLIGONUCLEOTIDI=PRIMER  questi saranno complementari alle regioni fiancheggianti la sequenza di interesse da amplificare.

I due primers sono definiti:

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