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Ficoeritrina (PE): viene eccitata dalla stessa lunghezza d’onda del FITC (488 nm), quindi possono essere usati insieme per realizzare un sistema di rilevazione molto sensibile in doppia marcatura.

Quindi PE e FITC: emettono lunghezze d’onda diverse  quindi ognuno emette un colore diverso [emettendo colori diversi, posso distinguere PE e FITC e di conseguenze i MoAb che questi coloranti legano].


CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO OGGI

Negli ultimi anni la CFM ha raggiunto una notevole diffusione, sia in laboratori clinici che in laboratori di ricerca; la CMF è una tecnica largamente utilizzata in tutti i lab.



Fattori che hanno contribuito a questo notevole sviluppo:

  • la possibilita’ di utilizzare piu’ laser di emissione, che permette di effettuare analisi multiparametriche a 4 e piu’ colori

  • la disponibilita’ di MoAb marcati con un’ampia gamma di fluorocromi e diretti contro una larghissima varieta’ di Ag di membrana e/o intracellulari;

  • la riduzione dei costi e della complessita’ nell’utilizzo dello strumento.

APPLICAZIONI

La CMF permette di analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo (50.000 cellule in pochi secondi), quantificando numerosi parametri per ogni singola cellula.

Abbiamo 1 evento, e per 1 evento ci riferiamo a a 1 singola cellula, e la CMF permette di determinare di questa cellula:



  • il contenuto di DNA, di RNA, i diversi sottotipi cellulari, gli organelli intracellulari, l’attivita’ di alcuni enzimi.

  • Studio della ploidia e della proliferazione cellulare

  • analisi del ciclo cellulare

  • ANALISI IMMUNOFENOTIPICA MULTIPARAMETRICA:

in una popolazione eterogenea, vogliamo vedere come sono espressi determinati Ag

  • Risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (cellule

  • antigene specifiche, produzione di citochine, ecc)

  • Livelli di apoptosi in patologie associate a deplezione cellulare (es AIDS) o accumulo cellulare (tumori);

  • ecc ecc!!!!!

VANTAGGI


  • POSSIBILITA’ DI ANALISI MULTIPARAMETRICA

  • ELEVATO NUMERO DI CELLULE ESAMINATE:

possiamo analizzare un elevato numero di cellule in secondi.

  • RAPIDITA’ DEI TEMPI DI ANALISI (OLTRE 1000 CELLULE/SEC)

  • OBIETTIVITA’, RIPRODUCIBILITA’ E AFFIDABILITA’ STATISTICA DELLE LETTURE

  • I CAMPIONI POSSONO ESSERE PROCESSATI SENZA PERDERE LA VITALITA’ CELLULARE:

possiamo utilizzate la CMF anche per, dopo averla analizzata, recuperare viva la popolazione cellulare che ci interessa [questo processo si chiama sorting]  questo è importante perché questa popolazione cellulare viva la possiamo mettere in coltura.
LIMITI

  • analisi di cellule molto rare [nel senso poche cellule], che a causa del loro ridotto numero in confronto agli eventi analizzati potrebbero essere difficilmente separabili dal “rumore di fondo”

  • necessita’ di dover lavorare con campioni in fase monodispersa:

cioè devo sospendere le cellule. Es staccarle dalla piastra di coltura e metterle in soluzione, oppure devo fare un prelievo dal pz [e mettere il suo sangue in soluzione].

  • Impossibilita’ di localizzare la sede di provenienza del segnale in caso di contemporanea presenza di marcatori nei diversi compartimenti cellulari:

es se vogliamo studiare proteine presenti nel apparto di Golgi, anche se usiamo 2 fluorocromi diversi, non riusciamo a sperare 2 segnali che sono attaccati, e dunque questo rappresenta un limite.

PRINCIPI DI FUNZIONAMENTO DELLA CFM

Una sospensione cellulare monodispersa (cellule da sangue periferico, aspirato midollare, ecc.) viene iniettata in un sistema fluidico il quale tende, in opportune condizioni idrodinamiche, a trasportare le cellule in maniera separata e ordinata fino al punto di misura, dove incontra il fascio di luce focalizzata proveniente dal laser.

L’incontro tra il raggio di luce e ogni singola cellula presente nel flusso cellulare genera dei segnali.

Questi segnali sono legati alle caratteristiche fisiche della cellula e alla presenza di molecole fluorescenti.

I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici, e inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l’intensita’.

I segnali elettrici provenienti da ogni sensore, opportunamente amplificati e digitalizzati, sono inviati ad un analizzatore di dati che provvede alla loro visualizzazione su monitor, rappresentazione grafica, e definizione statistica.

Delle cellule in sospensione, ricorda che ogni cellula è un evento.


COMPONENTI DI UN CITOFLUORIMETRO A FLUSSO

Schema a dx. Abbiamo il campione.

Ogni singola cellula passa attraverso questo sistema, in cui il laser colpisce ogni singola cellula: il laser verrà


  • riflesso

  • o rifratto

  • o difratto

e questo dipende da: dimensione, densità del citosol (=granulosità);

esiste poi un sistema che processa la dispersione della luce delle cellule, e converte il segnale da analogico a digitale e abbiamo dunque una rappresentazione grafica.

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DELLA CMF

Partiamo con una popolazione eterogenea di cellule legate a MoAb, e ogni MoAb è marcato con sostanze fluorescenti diverse.



  1. Le cellule di questa popolazione eterogenea vengono aspirate dalla provetta e immesse in una camera di flusso [dentro questa vi è il sistema fluidico] dove vengono separate le une dalla altre [è importante separarle].

  2. Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente

  3. Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi [usati per elaborare il segnale emesso].raggiunge un rivelatore.

  4. Viene quindi processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale e inviato all’analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico.

  5. Attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito “sorting”. Non tutti gli strumenti di citofluorimetria possono permettere di fare un sorting.

COMPONENTI DI UN CITOFLUORIMETRO A FLUSSO

1)SISTEMA FLUIDICO:

il sistema di dispensione del campione liquido fornisce un efficiente mezzo in grado di presentare individualmente [=in maniera separata] le cellule del campione alla stazione di misura, dove intersecano il raggio di luce emesso dal laser.

E’ importante evitare la formazione di aggregati cellulari: perché noi misuriamo i singoli eventi, e ogni evento è una singola cellula.

La velocita’ di efflusso delle cellule viene valutata come numero di eventi al secondo: numero di particelle [=cellule] che hanno incontrato il raggio di luce nell’unita’ di tempo.

individualmente=in maniera separata. No aggregati:


2)CAMERA A FLUSSO

Le cellule monodisperse (da sangue periferico, da aspirato midollare, agoaspirato da tessuti

solidi…) vengono aspirate in una camera a flusso, dove vengono diluite e allineate tramite un sistema fluidico a flusso laminare.

Nel flusso coesistono una corrente interna ed una esterna, la quale confina la sospensione cellulare al centro del flusso. La pressione di spinta e la diluizione del campione consentono di contare fino a qualche migliaia di cellule al secondo.




3)SORGENTI LUMINOSE

Nella grande maggioranza dei citofluorimetri si utilizza una sorgente luminosa ad ioni Argon centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). Tale luce consente una efficace misura dei parametri fisici, inoltre permette la contemporanea

eccitazione di diversi fluorocromi.

Se e’ necessario utilizzare altre lunghezze d’onda bisogna utilizzare altri tipi di laser (es Kripton, Elio Neon, ecc)

I laser hanno costi molto elevati!!!

Un’analternativa piu’ economica e’ costituita dall’uso dei citometri a lampada, che hanno come fonte di eccitazione una lampada a vapori di Mercurio o Xenon che non richiede particolari sistemi di raffreddamento. Sono utili per le applicazioni che riguardano particolari fluorocromi (es quelli utilizzati per la marcatura del DNA).

LIMITI: bassa potenza erogata, scarsa stabilita’ della luce di emissione, rapido decadimento
Cioè che c’è scritto su è per dire che: i citofluorimetri dipendono dalla sorgente luminosa che utilizzano; quelli più sofisticati usando sorgenti luminosi diverse che sono più costose.
4)PARAMETRI FISICI:

quando viene colpita dal fascio di luce emesso dal laser, la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche, per fenomeni di rifrazione, riflessione, e diffrazione.

In particolare [sapere ste cose]:


  • la luce dispersa in avanti, detta FORWARD SCATTER: e’ legata alle dimensioni delle cellule.

Quindi la luce forward scatter ci dà informazioni sulle dimensioni delle cellule.

  • mentre la luce riflessa a 90° , detta SIDE SCATTER: e’ da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la granulosita’ del citoplasma, il rapporto nucleo/citoplasma, la rugosita’ di superficie.

Quindi la luce side scatter ci dà informazioni sulla granulosità.
Il risultato finale è il CITOGRAMMA: diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione dei segnali rappresentati da: forward (che ci indica le dimensioni) e del side (granulosita’) scatter.

Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche.

Sul grafico del citogramma a dx:


  • Su y=forward,su y .

Vediamo che: quella nuvola cerchiata in rosso indica i linfociti, quell’altra nuvola cerchiata in giallo indica come sono distribuiti i granulociti ecc.


5)SEGNALI DI FLUORESCENZA

in citofluorimetria vengono rilevati segnali fluorescenti generati:



  • dall’utilizzo di MoAb marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc) specifici per antigeni presenti sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo:

Noi abbiamo visto FITC e PE.

l’RNA:

cioè Possiamo ottenere segnali di fluorescenza non solo con IG+fluorocmormo, ma anche usando fluorocromi che si legano direttamente a DNA o RNA.


Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d’onda per l’eccitazione e l’emissione.
Limiti alla scelta di fluorocromi da utilizzare in combinazione:

  • La lunghezza d’onda di eccitazione

  • Le bande di emissione devono essere sufficientemente separate da permettere la loro

appropriata misurazione.

COME LAVORANO I FLUOCROCROMI?

Slide a dx.


  1. Un laser eccita il fluorocromo

  2. il fluorocromo eccitato sale nel livello successivo della nuvola elettronica

  3. il fluorocromo ritorna al livello originale e rilascia l’energia in eccesso come fotone

  4. i fotoni emettono a lunghezze d’onda maggiori rispetto a quelle a cui vengono eccitati

Se vogliamo usare contemporaneamente 2 fluorocromi diversi, questi devono:



  • essere eccitati alla stessa lunghezza d’onda [perché usiamo la stessa sorgente laser]

  • ma poi devono emettere fotoni a lunghezze d’onda diverse perché in base alla lunghezza d’onda varia il colore emesso [e il colore ci permette di discriminare i fluorocromi]  cosi la macchia può discriminare i diversi Ag.

Per ogni laser [che emette una luce ad una specifica lunghezza d’onda]: dobbiamo usare fluorocromi specifici, perché un fluorocromo è eccitato da una specifica lunghezza d’onda del laser.


COM’E POSSIBILE OTTENERE COLORI DISTINTI?

  • fluorocromi diversi hanno lunghezze d’onda diverse

  • L’eccitazione proviene dal laser. Ci sono 4 diverse opzioni: 488nm Blue, 633nm Red, 405nm violet, 350nm UV.

  • La lunghezza d’onda di emissione è più alta di quella di eccitazione.

  • Usando filtri e specchi è possibile separare le diverse lunghezze d’onda ed inviarle a diversi detectors

Grafico a dx:



  • FICT: dal grafico vediamo come la lunghezza d’onda di eccitazione è diversa dalla lunghezza d’onda di emissione [che è maggiore].

  • PE: ha la stessa lunghezza d’onda di eccitazione del FICT, ma la lunghezza d’onda di emissione è diversa.

Quindi possiamo distinguere la IG monoclonale legata al FICT o al PE  questo ci permette di fare una analisi multiparametrica.

CITOMETRIA A FLUSSO OGGI

Questo strumento ci permette di fare un’analisi multiparametrica, e non ha un costo elevatissimo. È uno strumento piccolo collegato a un pc che deve trasformare in grafico quello che lo strumento emette.

ELABORAZIONE E RAPPRESENTAZIONE DEI DATI

L’elaborazione dei dati e’ eseguita grazie al computer collegato allo strumento, che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo reale.
Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico.

1)La rappresentazione piu’ semplice e’ costituita dall’ ISTOGRAMMA [vedi slide a dx] dove:



  • l’ascissa riporta l’intensita’ di fluorescenza

  • e l’ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l’antigene (diagramma di distribuzione).

L’analisi statistica si basa:

  • sull’impostazione di cursori che delimitano le aree di interesse,

  • e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree.

Nel grafico siamo andati a vedere la distribuzione del CD8 sulla popolazione di cellule: vediamo che il 59% ha una certa intensità di segnale, e il 35% ha un intensità di segnale maggiore  quindi è una popolazione eterogenea.

Possiamo dunque anche fare un’analisi statistica: sappiamo che nell’area indicata dal cursore [riga orizzontale nera], si distribuiscono quelle cellule e la macchina mi dice che sono il 60% delle cellule. Otteniamo dunque un grafico con dei picchi, e ogni picco rappresenta un’area delimitata dal cursore, che ci permette di identificare la % di cellule contenute in ciascuna area: in ciascuna area possiamo calcolare poi vari test statistici [quali valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, ecc].






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