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2)RAPPRESENTAZIONE BIDIMENSIONALE

Oltre all’istogramma, e’ possibile utilizzare una serie di rappresentazioni bidimensionali, che permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro.



  • Grafico a sx: anche qui ogni punto è 1 evento=cellula. A seconda di dove è localizzato il punto, capisco la quantità di espressione di CD4 e CD8.

  • Grafico a dx: vediamo che per aree scure in modo uguale, diciamo che queste aree hanno densità uguale.

In questa popolazione eterogenea che ho analizzato: posso decidere di voler fare un sorting della popolazione che ha la maggiore espressione di CD8 [sono quelle della nuvola più a dx del grafico a sx].

Si possono utilizzare altre rappresentazioni dove l’intensita’ del colore e’ proporzionale alla densita’ degli eventi.



  • grafico a sx:le rosse sono le più dense

  • grafico a dx: la densità maggiore si ha dove la colorazione è più nera.

APPLICAZIONI DELLA CITOFLUORIMETRIA

STUDIO DEL SISTEMA IMMUNITARIO

Una delle maggiori applicazioni della citofluorimetria e’rappresentata dall’analisi (e sorting) delle diverse popolazioni di cellule del sangue.

Si sfruttano fondamentalmente 2 caratteristiche:


  • la maggior parte delle cellule del sangue mostrano distinti profili di forward and side scatter

  • le diverse popolazioni cellulari esprimono sulla propria superficie markers specifici che le discriminano dalle altre

IMMUNOPHENOTYPING: cioè usiamo MoAb legati a sostanze fluorescenti; questi MoAb sono specifici per determinati antigeni.


GATING E SORTING

Es voglio discriminare la pop CD4 positiva dalla popolazione CD8 positiva.

Per fare un sorting, dobbiamo dare un gating: il gating è una condizione tale in cui la popolazione che vogliamo sortare, è separata sufficientemente per essere sortata.
L’analisi multiparametrica, uno dei piu’ potenti aspetti della citofluorimetria a flusso, permette di affrontare i problemi biologici della eterogeneita’ cellulare.

Sfrutta due operazioni fondamentali della CFM: il gating e il sorting.



  1. GATING:

utilizzando una finestra elettronica, permette di isolare una determinata popolazione da tutte le altre cellule, e di analizzare i parametri successivi solo all’interno della popolazione “ghettata” [=separata], dividendola cosi’ in ulteriori subpopolazioni.

  1. SORTING:

e’ un gating reale. Il termine “sorting” indica la capacità di un citofluorimetro (FACS), di raccogliere fisicamente le sottopopolazioni cellulari separate dalla popolazione eterogenea iniziale in base alla diversa espressione antigenica.

Si stabiliscono delle finestre di selezione per identificare le popolazioni di interesse che verranno separate e raccolte in provette distinte.

Le cellule mantengono la vitalita’ dopo il sorting!!!
DI citofluorimetri ne esistono a circuito :


  • chiuso: il campione analizzato viene perso

  • aperto: il campione incontra il fascio di luce laser in aria, per poi essere recuperato selettivamente dopo il sorting.

STRATEGIE DI SORTING

Dobbiamo adottare strategie di gating. Le cellule che vogliamo recuperare e cioè positive per il marcatore di interesse, devono essere separate dalle altre popolazioni [questo è il gating].


  • SITUAZIONE IDEALE:

(fortunatamente abbastanza tipica): le cellule positive per il marcatore sono ben separate da quelle negative, rientrando quindi in una finestra ben definita.

supponiamo che la popolazione di nostro interesse sia il picco a dx; il grafico ci rappresenta la situazione ideale, perché il picco è ben separato dagli altri picchi.





  • PARZIALE SOVRAPPOSIZIONE:

della fluorescenza tra cellule positive e negative per il marcatore.

Se vi è una parziale sovrapposizione tra 2 picchi, potremmo avere una contaminazione da parte delle altre popolazioni che non ci interessa analizzare [cioè ci interessa solo uno dei 2 picchi sovrapposti]





  • PICCO UNIMODALE DI FLUORESCENZA:

in cui l’istogramma delle cellule positive presenta un leggero shift rispetto alle cellule non marcate.

In questo caso è impossibile fare un sorting, perché i picchi sono sovrapposti.



Il concetto è sempre lo stesso, a prescindere dal metodo di visualizzazione della CMF: la nuvola colorata della popolazione di nostro interesse deve essere separata dalle altre popolazioni.


ANALISI DEL CICLO CELLULARE

L’analisi citofluorimetrica viene utilizzata per analizzare il ciclo cellulare.

Con la CMF quantifichiamo il DNA.

Questa volta non usiamo MoAb legati a fluorocromi, ma usiamo sostanze fluorescenti che si legano direttamente al DNA.

Se le cellule si trovano in mitosi, hanno un contenuto 4n [si trovano in G2/M], quindi hanno un DNA maggiore rispetto a cellule che si trovano in G0 [queste hanno un contenuto diploide= 2n, si trovano in G0-G1].

Quindi studiando la quantità di DNA possiamo stabilire in una popolazione cellulare, quante cellule si trovano in: G0, S1, S2.

Un istogramma [grafico a dx] rivela la frazione/ quantità di cellule presente nelle varie fasi del ciclo cellulare, tramite dei picchi.
Vediamo coloranti che legano direttamente il DNA:


  • Propidium iodide:

e’ il colorante piu’ comunemente utilizzato. Dopo essersi legato al DNA, aumenta notevolmente la propria fluorescenza.

L’unico problema è che richiede la permeabilizzaizone della membrana plasmatica: cioè se le cellule non sono fissate [per essere fissate devono essere morte], il propidium iodide non riesce ad arrivare a colorare il DNA.



  • Hoechst 33342:

e’ meno utilizzato, ma rappresenta una valida alternativa quando e’ richiesto la colorazione di cellule non permeabilizzate (vive): cioè questo colorante è in grado di attraversare la membrana cellulare, e quindi possiamo usarlo anche su cellule vive.
Il monitoraggio della proliferazione cellulare e posizione in ciclo per mezzo della misurazione del DNA quale singolo parametro pone diverse limitazioni:

  • non permette di distinguere cellule in G0 da quelle in G1:

infatti le cellule in G0 e G1 fanno parte dello stesso picco, questo perché possiedono lo stesso contenuto di DNA

  • non permette di distinguere cellule in G2 da quelle in M, (stesso contenuto di DNA);

  • totale mancanza di informazioni circa la cinetica cellulare.

ANALISI MULTIPARAMETRICA:

Oltre all’analisi che usa il Propidium iodide, possiamo fare un’analisi multiparametrica: cioè assieme al contenuto di DNA vengono valutati altri parametri della cellula strettamente correlati alla sua posizione nel ciclo.

L’analisi multiparametrica e’ diventata il metodo preferenziale per studiare le connessioni tra la progressione nelle varie fasi del ciclo di una cellula e la sua crescita (es contenuto di RNA, specifiche proteine), attivazione (es specifici

markers di superficie), proliferazione (es Ki67, specifiche cicline) e differenziazione (es specifici markers tumorali).
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI TRAMITR ANNEXIIN 5

Durante l’apoptosi le cellule subiscono specifiche modificazioni morfologiche, che portano alla perdita dell’integrità della membrana, alla formazione di corpi apoptotici e alla morte della cellula.

Un cambiamento che avviene nella membrana cellulare durante le prime fasi del processo apoptotico è la traslocazione della phosphatidylserine (PS) dal lato interno della membrana a quello esterno.

E’ possibile rilevare PS utilizzando Annexin V marcata, una proteina di 35 kDa che in presenza di specifiche concentrazioni di calcio è in grado di legarsi con alta affinità alla PS.



Con questo metodo valutiamo cellule che si trovano in apoptosi precoce.


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