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3)SINTESI:

  • La sintesi avviene a 72°. Questa T è ottimale per la TAQ polimerasi. La TAQ polimerasi è stata purificata da un batterio termofilo che è il Thermus aquaticus. Questa TAQ è diversa da quella delle nostre cellule proprio perché resiste ad alte T.

  • Esiste anche un'altra DNApol purificata da un altro microrganismo detta PFUpol: anche questa resiste ad alte T , però rispetto alla TAQpol incorpora meno errori quando polimerizza.

TAQ o PFU.
Infatti una DNApol quando polimerizza può anche incorporare nucleotidi sbagliati, però quella della nostra cellula ha anche un attività esonucleasica 3’-5’ (normalmente una DNApol sintetizza in 5’-3’, quindi l’attività esonucleasica procede al contrario per rimuovere il nucleotide sbagliato).

Ma la TAQpol non ha l’attività esonucleasica, quindi può far errori (neanche la PFU ha l’attività esonucleasica, però la PFU fa meno errori).

Ma se la PFU è meglio della TAQ, perché esiste anche la TAQ allora?

Perché la TAQ è stata quella più usata in passato, e costa anche meno della PFU.

La PFU è subentrata temporalmente più tardi, oggi in quasi tutti i lab usiamo la PFU, quindi noi oggi se vogliamo fare una PCR ordiniamo la PFU, anche se la PFU è più cara.

Questo ciclo a 3 fasi detto su: viene ripetuto 30 volte – fino a max 35 volte, in modo tale da avere una sintesi esponenziale di DNA.

Alla fine della reazione di PCR abbiamo un’amplificazione del DNA esponenziale: partiamo da 4 copie (22) e aumentiamo l’esponente (vedi slide giù a dx), ad ogni ciclo l’aumento è esponenziale.

VERIFICA DEI PRODOTTI DI PCR SU GEL DI AGAROSIO

Perché vogliamo amplificare una specifica sequenza di DNA (=uno specifico frammento di DNA)? Per vedere se, dopo sequenziamento, presenta una mutazione di un gene (ad esempio il gene BCL).

Come faccio a sapere se le sequenze di DNA che ho amplificato, corrispondono proprio alla sequenza di DNA che volevo amplificare? Lo faccio eseguendo un elettroforesi del DNA: cioè carico il frammento amplificato su un pozzetto, faccio correre il frammento, ricorda che nell’elettroforesi dobbiamo usare dei marcatori per capire quali sono le dimensioni del frammento che metto nel pozzetto.

Nella slide vediamo 5 pozzetti (quelli da 1 a 5): in ognuno di questi metto un frammento / un amplificato , ottenuti da 5 PCR diverse fatte da 5 soggetti diversi.

Nel pozzetto ladder metto il marcatore.

Supponiamo che volevo un frammento intorno a 700 basi: in quale di questi pozzetti avevo messo il frammento che corrisponde a 700 basi? Sono il pozzetti 2 e il pozzetto 4.

Vediamo che:



  • nel pozzetto 1: è stato messo un amplificato di 1857 basi, perché il soggetto che ha fatto questa PCR (con cui ha ottenuto l’amplificato di 1875 basi) ha sbagliato; a questo punto ci si chiede, perché la sua PCR non ha funzionato?

Per caso Il templato era sbagliato? Non può essere, il templato è giusto, perché se no non potrei amplificare niente, e questo soggetto comunque qualcosa ha amplificato.

Il soggetto 1 :



  • potrebbe aver impostato una temperatura di appaiamento molto bassa; supponiamo che il suo primer si appaia a 50 °, ma lui ha messo 40°: quindi i suoi primer si sono legati sia alla zona giusta che anche in altre zone (non giuste, quindi in modo aspecifico).

  • Oppure ha messo poco Mg, quindi deve ripetere la PCR modificando la concentrazione di Mg.

  • nel pozzetto 3: il soggetto 3 non ha ottenuto nessun amplificato con la sua PCR (perché non vediamo nessun frammento che è corso con l’elettroforesi). Il soggetto 3 ha sbagliato a mettere il templato; anche se avesse messo oligonucleotidi e TAQpol giusti, senza templato non si può amplificare niente.

OTTIMIZZAZIONE DELLA PCR

Come facciamo ad ottimizzare la PCR, cioè cosa dobbiamo rispettare affinchè la PCR avvenga correttamente?


  • Concentrazione di Mg

  • Scelta dell’enzima e sua concentrazione

  • Progettazione dei primers:

questi sono di norma compresi tra 20 e 30 nucleotidi e non dovrebbero mai essere

  • Il contenuto in GC dovrebbe essere compreso tra il 45 ed il 50%, il primer non dovrebbe contenere sequenze tra loro complementari o ripetute invertite per evitare la formazione di dimeri di primer o strutture a forcina

  • Quantità e qualità dello stampo: ricorda come si isola il DNA (lo abbiamo fatto alla prima lezione). La qualità può venir alterata se ho lasciato del fenolo o proteine nel DNA, oppure se ho sbagliato a calcolare la concentrazione di DNA.

  • Parametri dei cicli

  • Controllo di cross-contaminazioni con altri acidi nucleici

PROGETTAZIONE PCR



  1. Scegliere la strategia: cioè scegliamo se il nostro stampo è DNA o RNA.

La PCR quantitativa serve per misurare quanto mRNA è presente in quella cellula, e quindi quanto un gene è espresso e quindi quanta proteina di quel gene c’è nella cellula.

Un’alta tecnica quantitativa per misurare il mRNA: è il northblot.



  1. Dimensioni della regione da amplificare

  2. Usare programmi per progettare i primers nella regione scelta o conoscere le regole generali

  3. Verificare la validità "biologica" dei primers tramite il servizio BLASTN per cercare eventuali somiglianze con altre zone oltre quella attesa, nella stessa regione o nell'intero genoma. BLASTN è un software che permette di allineare la sequenza di interesse con tutte le sequenze depositate nei diversi database di sequenze nucleotidiche. Con questo approccio si potrà verificare se il primer s o l’as riconoscono in modo specifico solo la sequenza d’interesse.

Spiegazione:

dobbiamo usare dei programmi di DNA detti BLASTN, per progettare i primer della regione scelta.

Ci sono regole generali per la creazione di un primer:


  • quella della GC

  • poi ci sono altre regole

Il BLASTN è un’interrogazione che noi facciamo al pc, usando questo motore di ricerca detto BLASTN: gli domandiamo, ma il primer che io ho scelto, in quante regioni di DNA ipoteticamente può annilare? In questo modo posso escludere i primer che possono legarsi a molte regioni del DNA, questo mi permette di evitare di ottenere molti amplificati aspecifici (questo avviene se il mio primer si lega su sequenze di DNA in modo aspecifico).

  1. Verificare la sequenza, attraverso sequenziamento, del prodotto di amplificazione previsto:

una volta ottenuto l’amplificato, per essere sicuri di aver amplificato la regione giusta: non posso solo basarmi sul controllo delle dimensioni tramite elettroforesi (come visto prima), ma devo anche sequenziare il frammento amplificato (cosi capisco se è la sequenza che volevo)!!
PCR

VANTAGGI:



  1. Sensibilità e rapidità

  2. Analisi simultanea di molti campioni

  3. Analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione:

cioè la PCR permette proprio di analizzare contemporaneamente molto campioni. Ma esistono anche tecniche migliori per l’analisi simultanea di molti campioni. Es ho 90 campioni da amplificare: uso una piastra con 90 pozzetti, e cosi ottengo il risultato di 90 amplificazioni.

  1. Analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato:

cioè la PCR permette anche di analizzare DNA non perfettamente puro.
SVANTAGGI:

  1. Sensibilità: rischio di contaminazioni-falsi positivi  per contaminazione: intendiamo l’amplificazione aspecifica di frammenti del DNA /amplificazione di aspecifici.

  2. Efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza:

a volte posso decidere di cambiare la sequenza da amplificare perché la sequenza che volevo amplificare è troppo ricca di G C; a volte però sono costretta ad amplificare questa sequenza ricca di G e C.

  1. Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto delle coppie di oligonucleotidi di innesco (primers):

cioè devo conoscere almeno le estremità del frammento che voglio amplificare, perché sono io che devo decidere le sequenza SENSE e ANTISENSE 8 (sono i miei oligonucleotidici complementari al frammento che voglio amplificare, vedi prima). .

Io posso anche non conoscere la sequenza all’interno (del frammento che voglio amplificare), e posso comunque amplificarlo; però devo sapere almeno i primi 30 nucleotidi (sia dell’estremità 3’ che 5’), se no non posso disegnare i primer.

Questa conoscenza parziale della sequenza di DNA che voglio amplificare è un fattore limitante.


  1. Può sintetizzare frammenti relativamente corti (< 5000 bp):

cioè non possiamo amplificare frammenti troppo lunghi. Il frammento che vogliamo amplificare deve essere lungo meno di 50000 bp.

Più è lungo il frammento amplificato, più è elevata la probabilità di introdurre errori; quindi è meglio e facile amplificare frammenti piccoli.

Le dimensioni medie dell’amplicone sono 0,1-5 kb.


  1. La sintesi è imprecisa e può introdurre errori nella sequenza:

perché la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica, quindi se incorpora una base sbagliata questa base non può venir rimossa.

Anche la PFU ha una possibilità di errore: quindi dobbiamo sempre in ogni caso ricontrollare il prodotto amplificato.


LA REAL TIME PCR /PCR QUANTITATIVA

Parliamo della RT-PCR (=real-time PCR).

È una PCR che viene usata per identificare uno specifico mRNA.



Questa volta la PCR la facciamo cosi:




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