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estraiamo l’RNA (quindi sta volta partiamo da RNA, e non DNA)

  • purifichiamo l’RNA.

    Ricorda che mRNA al 3’ ha una coda di A. L’unico mRNA che nelle nostre cellule non viene poliadenilato è quello degli istoni.

    Queste code di poli A servono a stabilizzare mRNA, Ed è grazie a queste code di poli A che possiamo amplificare gli mRNA, perché usiamo resine che contengono oligodT complementari alle adenine e cosi possiamo isolare gli mRNA.



    1. dal mRNA sintetizziamo il cDNA: è il DNA complementare al mRNA che abbiamo estratto nel punto 1. A questo punto possiamo trattare questo cDNA come fosse un qualunque DNA, ed effettuare una PCR (come spiegata prima). Noi vogliamo misurare la quantità di cDNA che corrisponde al gene che stiamo studiando.

    La RT-PCR è una PCR che viene effettuata dopo che abbiamo eseguito una retrotrascrizione: cioè abbiamo isolato mRNA dalla cellula, e poi abbiamo sintetizzato il cDNA (infatti da RNA siamo passati a DNA).


    Quando facciamo la PCR (sia qualitativa che quantitativa): immaginiamo di fare un grafico, in cui mettiamo su:

    • X: il n° cicli

    ricorda che possiamo arrivare a fare fino a 30-max 35 cicli, ripetendo le 3 fasi della PCR ad ogni ciclo.

    • Y: il logaritmo del templato di DNA che mettiamo all’inizio della PCR

    Vediamo che il prodotto di PCR aumenta esponenzialmente, fino a raggiungere un plateau oltre cui il prodotto di PCR non aumenta più.

    Dal grafico vediamo che il prodotto di PCR dipendente dalla quantità di:



    • templato (y)

    • e il n° di cicli (x)

    Nel grafico:

    • Fase blu: è la FASE ESPONENZIALE

     cioè nella quale il PRODOTTO DI PCR/l’AMPLIFICATO aumenta, e questo aumento è proporzionale alla quantità di templato iniziale: cioè più templato iniziale c’era nel mio campione, maggiore sarà la quantità di prodotto di PCR.

    • Fase verde: FASE LINEARE  in cui il prodotto di PCR continua ad aumentare, anche se in modo più lineare; ha le stesse caratteristiche della fase esponenziale

    • Fase rossa: PLATEAU  qui non abbiamo più un aumento del prodotto di PCR. Inoltre il prodotto di PCR qui NON dipende più dal templato iniziale.

    Noi possiamo usare la real-time PCR/PCR quantitativa per calcolare la quantità di templato che abbiamo, e quindi di mRNA in quella cellula (se il mio templato è RNA, voglio capire quanti RNA ci sono nel mio campione).

    Quindi per usare la PCR in modo quantitativo, dobbiamo sfruttare tecniche che misurano il prodotto di PCR NON al plateau, ma nella fase lineare  perché è nella fase lineare che il prodotto di PCR che misuriamo è proporzionale alla quantità di templato.

    Ci chiediamo ad esempio: quanto mRNA di myc è presente nella cellula (da cui estraggo l’intera quantità di RNA, da analizzare nella PCR quantitativa) ?  lo scopro facendo una PCR quantitativa.


    23 MARZO

    La PCR quantitativa si usa per studiare l’espressione: è una terminologia che viene usata, ma cosa vuol dire?

    Significa studiare l’espressione genica: nel senso che utilizziamo la PCR per rilevare quanto è espresso un mRNA all’interno di una cellula (è la misura del mRNA che infatti mi quantifica quanto un gene viene espresso!); quindi in questo caso la PCR NON la usiamo per amplificare un frammento di DNA per poi clonare e sequenziare (come abbiamo invece usato la PCR nelle lezioni precedenti).
    Per ora ci siamo occupati dello studio di un SINGOLO gene, di un singolo mRNA, di una singola proteina.

    Micro-ARRAY: sono chip, usati per studiare invece tanti geni, tutti insieme nello stesso momento, e velocemente.

    Ora continuiamo a parlare di RT-PCR.
    Se vogliamo studiare l’espressione, da quale molecola partiamo?

    Dobbiamo estrarre RNA (e non DNA) dalle nostre cellule.

    Ricorda: in biologia molecolare, non ci interessa studiare semplicemente l’espressione di una cellula, ma ci interessa la sua espressione quando facciamo un CONFRONTO tra 2 fenomeni, cioè per capire se un gene/proteina è espresso in modo diverso in una


    • cellula normale - rispetto a una tumorale

    • oppure in una cellula normale sana – rispetto a una cellula normale sottoposta a un farmaco o stress ossidativo

    Quando estraiamo RNA: questo è un RNA totale, cioè contiene tutte le specie di RNA  rRNA, tRNA, mRNA (mRNA è quello presente in % minore nella cellula).

    Infatti quando carichiamo l’RNA totale per fare un elettroforesi (ricorda che l’elettroforesi la usiamo per separare le varie specie molecolari in base a PM e carica elettrica), e lo coloriamo con etidio (come abbiamo fatto per il DNA, è un colorante che si intercala tra i nucleotidi): vediamo che, del RNA totale, la specie più rappresentata è rRNA, e anzi mRNA non riusciamo a visualizzarlo  per visualizzare mRNA ,dobbiamo isolarlo dalle altre specie di mRNA e caricare SOLO mRNA nell’elettroforesi.

    A questo punto produciamo il cDNA: cioè copia di DNA complementare al mRNA.

    Il cDNA lo otteniamo grazie a una RT (retrotrascrittasi / trascrittasi inversa).


    RIVEDI IL GRAFICO DI PRIMA DELLA PCR

    Io voglio trovare un sistema per misurare la quantità di amplificato che io ottengo: è appunto una PCR quantitativa.

    Supponiamo di voler studiare myc nella cellula A e nella cellula B: con la PCR quantitativa, voglio sapere quanto myc c’è nella cellula A (cioè quanto quella cellula esprime il gene myc) e quanto myc nella cellula B.


    • IN UNA PCR QUALITATIVA / detta PCR END-POINT (è la PCR classica)

    Ho messo il mio mix nel tubo del macchinario per fare la PCR, e ho fatto fare i miei 30-35 cicli di amplificazione.

    Arriviamo a un plateau, perché la macchina non riesce ad amplificare ulteriormente il templato (che è DNA o cDNA) che ho messo.

    A questo punto ho il mio amplificato/prodotto di PCR nel tubo, e ora faccio un elettroforesi col prodotto finale della PCR (che è DNA), per controllare che la PCR sia avvenuta nel modo corretto.


    • IN UNA PCR QUANTITATIVA/RT-PCR:

    Se voglio studiare l’espressione: mi serve una tecnica (che è la RT-PCR), che lavora in un momento in cui l’amplificazione è proporzionale al mRNA di partenza.

    Cioè nel tempo reale, mi misura quant’è la quantità di amplificato nella fase lineare; infatti se misurassi l’amplificato nella fase di plateau, la misura in questa fase non è proporzionale al templato di partenza.


    EFFETTO PLATEAU

    Perché ce lo abbiamo, cioè perché il macchinario non riesce più ad amplificare il templato? Perché:



    1. i primer ad un certo punto finiscono, e quindi non posso più amplificare

    2. la TAQ pol anche ad un certo punto finisce

    3. i filamenti di DNA tendono a riannilare (ricorda che io li avevo denaturati, per poterli rendere accessibili alla polimerizzazione), e quindi non posso più amplificarli

    Raggiunto il plateau, il prodotto della PCR non incrementa più quindi.

    Ricorda che il plateau non dipende dal templato (che ricorda può essere: DNA - o cDNA che deriva dal RNA) di partenza che io pipetto nel tubo.

    Del RNA totale della cellula, io voglio sapere quanto mRNA di myc c’è!

    Per sapere questo, se andassi a misurare il prodotto finale della PCR, non riuscirei a capire quanto mRNA di myc c’era nel campione iniziale: perché il plateau è indipendente dalla quantità del mRNA che mi interessa misurare.

    Quindi l’unico modo per misurare quanto mRNA di myc c’è: è misurare NON nella fase di plateau (la PCR qualitativa, misura il prodotto di PCR finale, quindi questo della fase di plateau) ma quando la PCR è nella fase esponenziale (che è invece proporzionale alla quantità di templato!).

    Per rilevare il prodotto di PCR durante la fase esponenziale: ci basiamo sul rilevamento di una fluorescenza, che viene rilevata dal macchinario in tempi reali (cioè mentre sta avvenendo amplificazione) e visualizzata al computer.

    Più fluorescenza viene rilevata dal macchinario, più mRNA di myc abbiamo.
    Perché la chiamiamo real-time PCR?

    Perché misura l’amplificazione in tempo reale, durante la fase esponenziale: cioè l’amplificazione è infuenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale ‘end-point’.

    La PCR end-point misura il prodotto di PCR nella fase di plateau: perché con la PCR end-point noi misuriamo il prodotto di PCR solo con elettroforesi!

    Mentre la real-time PCR misura il prodotto di PCR prima della fine, e cioè nella fase esponenziale, proprio grazie alla fluorescenza (e quindi poi non analizziamo il prodotto di PCR tramite elettroforesi).


    CT ( CYCLE THRESHOLD): ci riferiamo al fatto che la macchina di PCR registra la fluorescenza, dopo che la fluorescenza emessa ha superato un livello soglia detto CT.

    Questo CT si raggiunge dopo 30 cicli.

    Se la fluorescenza viene registrata dopo 20 cicli per un gene, e per un altro gene dopo 30 cicli: significa che il gene che risulta fluorescente già dopo 20 cicli è più espresso rispetto al gene che risulta dopo 30 cicli, proprio perché raggiungiamo la soglia di fluorescenza prima; se invece sono necessari 50 cicli per osservare la fluorescenza, significa che questo gene è ancor meno espresso.


    CHIMICHE FLUORESCENTI PER PCR REAL-TIME

    Come facciamo a registrare questa fluorescenza?

    Dobbiamo usare sostanze che emettono questa fluorescenza.


    • possiamo usare il SYBR GREEN: è un colorante fluorescente che si intercala nella doppia elica del DNA (slide a dx) a random, non è quindi un colorante specifico.

    Vedi slide giù (da dx a sx, sono in ordine):

    1. All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione (il mix) contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente.

    2. Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

    3. Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone

    Quindi man mano che la DNA pol polimerizza, questo colorante si intercala ed emette fluorescenza.

    Quindi maggiore fluorescenza la macchina registra, maggiore amplificato abbiamo: la fluorescenza è infatti proporzionale al numero di ampliconi.

    La fluorescenza viene emessa a determinate lunghezze d’onda.

    Questa tecnica è un po’ aspecifica (perché il colorante SUBR GREEN si lega a random a tutte le doppie eliche, comprese dimeri di primer. Quindi l’utilizzo del SUBR GREEN ha dei limiti), ma è la meno costosa e quindi è quella più utilizzata.


    • un metodo più specifico è il metodo che usa sonde TAQMAN.

    Le TAQMAN sono sonde ad ibridazione che sono specifiche per il frammento di interesse e sono marcate con molecole fluorescenti. La sonda TAQMAN che compriamo è specifica per il gene la cui espressione noi vogliamo studiare (es myc).

    Quindi supponiamo di voler studiare myc: quindi dobbiamo sintetizzarci una sonda TAQMAN, cioè un oligonucleotide che è complementare a una parte della sequenza interna del gene myc. Oltre alla sonda TAQMAN, per studiare myc abbiamo sempre bisogno degli altri componenti del mix (quindi al posto di SYBR GREEN, metto TAQMAN).

    La sonda TAQAMN, s differenza del SYBR GREEN, è quindi specifica: di conseguenza è più costosa del SYBR GREEN. Quindi se in laboratorio ho meno soldi uso SYBR GREEN, se ho più soldi uso TAQMAN; la maggior parte dei laboratori usa SYBR GREEN, anche se a volte si è costretti ad ordinare sonde TAQMAN.

    La sonda TAQMAN si disegna conoscendo la sequenza di myc ; noi la ordiniamo indicando di farcela sintetizzare (esistono indicazioni online sulla sintesi della sonda).


    La sonda TAQMAN presenta (vedi slides giù):

    • all’estremità 5’  un colorante/fluorocromo detto ‘REPORTER’: è ad alta energia ed emette fluorescenza

    • all’estremità 3’  un colorante/fluorocromo detto ‘QUENCHER’: è a bassa energia e spegne la fluorescenza del reporter

    Se R e Q si trovano vicini: Q spegne l’effetto di R, perché i fotoni di R vengono assorbiti da Q.

    Quando r si avvicina a q, q spegne la fluorescenza di r.

    Nella RT- PCR: la DNA pol che avanza con la sua attività 5-3:


    1. Quando la DNA pol cliva R, R emette fluorescenza (è come se attivasse R in questa maniera).

    2. Mentre la DNA pol scorre da dove c’era R , verso dove c’è Q: abbiamo il segnale di fluorescenza dato da R.

    3. Ma quando la DNA pol raggiunge e cliva Q: Q spegne il segnale di fluorescenza dato da R.

    Queste fluorescenza è registrata in real-time: cioè mentre la DNA pol sta amplificando nella fase esponenziale.

    SOUTHERN BLOT

    Parliamo soprattutto nel Northern blot.

    Si chiama Southern blot, perché la tecnica è stata inventata dal signore Southern.

    La northern blot è stata chiamata cosi per contrapporla al Southern blot, ma non è stata inventata da un signor northern.
    Il soutern serve per:


    1. determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici

    2. E per studiare la struttura e l’organizzazione di un gene

    Nonostante il fatto che oggi abbiamo tecniche di sequenziamento del DNA, il southern oggi s si usa ancora per effettuare alcune diagnosi (quali diagnosi di paternità ecc).
    Come si fa il Southern blot (ved la primai slide giù):

    1. Partiamo dal DNA genomico (parliamo di soggetti eucarioti), preso dal sangue del soggetto.

    2. Questo DNA lo dobbiamo digerire con enzimi di restrizione specifici

    Cosa ottengo da questa digestione? Ricorda che l’enzima di restrizione ECO taglia in punti specifici del DNA detti GAAATCC (rivedi prima). Ma nel DNA ci sono molte sequenze GAAATCC: quindi otteniamo numerosissimi frammenti di DNA, l’enzima di restrizione ci serve proprio per frammentare il DNA.

    1. Ora separiamo questi frammenti di DNA con un elettroforesi.

    2. Southern ha inventato una tecnica per trasferire il DNA dall’elettroforesi su un FILTRO/MEMBRANA (vedi la 2° slide giù).

    Questo filtro può essere costituito di cellulosa o di nylon (oggi tutti usano nylon, in passato si usava cellulosa).

    Quindi dopo elettroforesi, il DNA contenuto nel gel di agarosio, mediante dei fogli di carta appositamente preparati imbevendoli di sali, viene trasferito su questo filtro (di nylon o nitrocellulosa).


    Il gel è lo strato celeste.

    Sopra il gel metto il fltro, e sopra a questo metto dei fogli di carta (imbevuti di Sali).

    In questo modo il DNA si trasferisce per capillarità: dal gel al filtro.

    Dopo il trasferimento, dobbiamo fissare il DNA al filtro:



    • se abbiamo usato un filtro di nitrocellulosa: riscaldiamo per 2h a 80°C

    • se abbiamo usato un filtro di nylon: effettuiamo una irradiazione con raggi UV.

    1. A questo punto però vogliamo conoscere la struttura solo di myc, non di tutto il genoma (noi sul filtro abbiamo tutto il genoma frammentato).

    Quindi io devo ibridizzare il filtro, con una sonda rappresentativa del gene che voglio studiare: se voglio studiare myc, devo usare un oligonucleotide che lega solo il gene myc.

    1. A questo puto devo trovare un metodo per visualizzare questo legame sonda-gene myc, quindi la sonda utilizzata è radioattiva: quindi io metto il filtro ibridizzato (cioè il filtro con legata la sonda) in un’autoradiografia, nella radiografia metto una lastra che verrà impressionata dal segnale radioattivo, e questo segnale radioattivo corrisponde proprio al legame della sonda con myc.

    Guarda sempre slide giù, a dx:



    • Con elettroforesi che effettuo nel punto 5: io non vedo bande discrete, ma vedo delle strisciate perché ho talmente tante bande (date dai numero frammenti che ho ottenuto con l’enzima di restrizione) che queste si avvicinano una con l’altra e quindi mi danno una striscia.

    • Le strisce sono propsio l’aspetto tipico di un DNA genomico digerito.

    • Nella lastra che effettuo nel punto 7: otteniamo invece bande discrete.




    SONDA=PROBE.


    IL SOUTHERN NELLO STUDIO DELLA VARIABILITA’ GENETICA Lsde RFLP

    Southern è usato nello studio della variabilità genetica (quindi studiato la struttura del gene).

    La tecnica usata è definita RFLP / RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMOPRHISM (slide giù).

    Facciamo un Southern blot per identificare polimorfismi in 4 individui diversi.

    Vedi su slide: abbiamo 4 DNA genomici di 4 soggetti; questi DNA li abbiamo digeriti con enzimi di restrizione.

    Dopo digestione del DNA, usiamo una sonda per esplorare un locus genico e dalla slide vediamo che:



    • Nel soggetto 1:

    • esiste il sito di restrizione, e quindi l’enzima di restrizione riesce a legarsi al locus genico e a tagliarlo.

    • Nel soggetto 2:

    • non esiste il sito di restrizione perché il soggetto 2 ha un polimorfismo sul sito di restrizione.

    Quindi quando andremo ad ibridizzare la zona genica con una sonda, la sonda si legherà a un frammento più grande rispetto al frammento che la sonda lega nel soggetto 1 (vedi slide: il frammento rilevato è quello legato dalla sonda. Il resto nel soggetto 1 viene tagliato, nel soggetto 2 resta).

    • Nel soggetto 3:

    • il sito per l’enzima di restrizione è presente e quindi avverrà il taglio. E’ presente però un’inserzione.

    • Nel soggetto 4:

    • il sito per l’enzima di restrizione è presente e quindi avverrà il taglio. E’ presente però una delezione.

    In base al PM dei frammenti legati dalla sonda, guarda sul gel di agarosio come si collocano i diversi frammenti:

    • il frammento del soggetto 2: è quello con PM minore

    • il frammento del soggetto 4: è quello con PM maggiore



    RIASSUNTO APPLICAZIONI PRATICHE DEL SOUTHERN BLOT:

    • ANALISI FORENSE

    • DIAGNOSI DI MALATTIE EREDITARIE (es.: fibrosi cistica,

    • distrofia muscolare, ecc.)

    • INDIVIDUAZIONE DI AGENTI PATOGENI NELLE INFEZIONI:

    Se non so se ho un infezione del virus della rosolia: prendo il DNA dal sito di infezione, faccio un Southern blot usando la sonda del virus. Se c’è infezione, ottengo il segnale di ibridizzazione sulla lastra, se non c’è infezione non ottengo il segnale.


    • ANALISI FILOGENETICHE

    • MAPPATURA DEL GENOMA

    • CONTROLLO DEGLI OGM

    DEL SOUTHERN BLOT VEDIAMO I:

    VANTAGGI


    • È una tecnica molto specifica: perché usa una sonda

    SVANTAGGI



    • i vari passaggi richiedono molto tempo:

    • richiede inoltre una quantità di campione iniziale sufficiente:

    per poter ottenere una corretta elettroforesi.

    Il trasferimento dal filtro nylon richiede 1 giorno, per ibridizzare richiede anche questa 1 altro giorno, la radiografia richiede 1-2-3 gg a seconda di come io ho lavorato efficientemente (se ho usato poco DNA, la radioattività sarà poca e quindi non riesco ad impressionare la lastra).

    Quindi in totale è una tecnica che impiega 1 settimana: per ottenere risposte su 1 solo gene!

    Oggi invece con le nuove tecniche riusciamo in 1 solo gg, ad ottenere informazioni su molti geni contemporaneamente; queste tecniche sono diventare anche meno costose.


    NORTHERN BLOT

    • Con il Southern:

    studiavamo i geni

    • ora con il Northern:

    studiamo l’espressione (cioè la quantità di specifici RNA).
    PROCEDURA PER IL NORTHERN BLOT

    1. isoliamo l’RNA totale

    2. separiamo l’RNA totale su elettroforesi su gel di agarosio (slide giù. per ora la Pellicci non fa ‘page’).

    Quando usiamo RNA, si preferisce usare un gel denaturante che contiene formaldeide o formalina: usiamo un denaturante perché RNA tende a ripiegarsi su stesso , e quindi per far in modo che RNA riesca a correre in modo adeguato nell’elettroforesi usiamo sostanze denaturanti che impediscono il ripiegamento del RNA su se stesso (per il DNA non serve).
    Vediamo l’aspetto del elettroforesi in cui ho caricato il campione di RNA:

    vedo solo rRNA (28S 18S). Quando vediamo le strisce demarcate cosi bene, significa che RNA non è degradato (prima abbiamo visto che se è degradato vediamo delle strisciate).

    mRNA abbiamo detto che non riusciamo a vederlo sul gel di agarosio , perché è poco abbondante.


    1. Trasferiamo RNA totale su filtro (di nylon):

    Vedi sulla slide come appare il gel dopo il trasferimento: restano solo tracce di RNA, questo indica un trasferimento corretto del RNA totale.

    1. ibridizziamo con una sonda radioattiva l’mRNA di interesse.

    Il procedimento è dunque uguale al Southern blot, l’unica differenza è che vogliamo in questo caso studiare l’espressione genica (e quindi gli mRNA).



    Elettroblot lo salta ora


    IBRIDAZIONE

    Cosa usiamo per ibridare RNA?

    Delle sonde radioattive, che vanno a legarsi specificatamente con mRNA che vogliamo studiare.
    La sonda marcata e’ aggiunta alla membrana con l’RNA da analizzare in tubi da ibridazione (circa 16 ore in stufe termostatate) in presenza di apposite soluzioni di ibridazione.

    Le soluzioni di ibridazioni, nel caso del RNA, contengono anche sostanze denaturanti (rivedi prima).

    La cassetta radiografica viene chiusa, la conserviamo a -20 ° cosi si impressiona meglio il segnale fotografico: e cosi otteniamo il film/la fotografia/ la lastra  il segnale ottenuto sulla lastra corrisponde al gene che stiamo studiando.

    DISIBRIDAZIONE DELLA MEMBRANA

    Con opportuni lavaggi, usando soda a 100 °C, possiamo eliminare la sonda appena usata  e a questo punto possiamo usare la stessa membrana per ibridizzarla con un’altra sonda (per studiare un altro gene).

    ALCUNE APPLICAZIONI

    Quando si studia l’espressione , la prima domanda che ci si chiede: questo gene è


    • housekeeping (cioè è espresso uguale in tutte le cellule)

    • oppure l’espressione è tessuto-specifica (es espresso solo nel cervello)?

    In passato, per rispondere a questa domanda veniva fatto un Northern blot cosi:

    prendiamo tutti i tessuti di un topo, li dobbiamo digerire con enzimi particolari, estraiamo RNA da tutti i tessuti, li carichiamo su elettroforesi, trasferiamo RNA del elettroforesi su nylon, e a questo punto ibridizziamo il gene ‘x’ che ci interessa (useremo quindi una sonda rappresentativa del gene ‘x’, che ibridizza solo col mRNA del gene ‘x’).

    Alla fine otteniamo quindi un film/lastra:


    • a dx vediamo la banda che ci aspetteremmo se il gene ‘x’ fosse espresso.

    • vedi che in alcuni tessuti c’è un assenza di banda, e questo vuol dire che in questi tessuti il gene non è espresso (infatti non c’è l’mRNA del gene sulla lastra, infatti la sonda non l’ha trovato e quindi sulla lastra non c’è nessun segno).

    • C’è un tessuto che esprime il gene ‘x’ di più e uno di meno?

    Si, lo noto osservando l’intensità delle bande: vediamo che nel cervello l’intensità è maggiore e quindi l’espressione è maggiore.

    • Inoltre, vediamo che il cuore presenta una banda con dimensioni più piccole (1,4 kb contro 4,4 kb): significa che il cuore esprime qualcosa che viene riconosciuto da quella sonda specifica, ma questo qualcosa ha dimensioni diverse rispetto agli altri tessuti che vediamo; quindi ipotizzo che il cuore abbia uno splicing alternativo di quel gene (che ci sia effettivamente uno splicing alternativo poi lo dovrò dimostrare tramite sequenziamento… comunque il northern blot ci mostra che c’è un’espressione diverse del gene, pur essendo espresso).

    Oltre alle motivazioni dette su: cosa può influire nel farmi ottenere una banda grossa e una banda piccola?

    La quantità di RNA che ho caricato!

    Infatti potrei ottenere un’intensità maggiore perché ho caricato più RNA, oppure non mettendo RNA non otteniamo nessuna banda.

    E quindi come dimostro che io avevo caricato del RNA nella stessa quantità in tutti i pozzetti dell’elettroforesi?

    Vado ad ibridizzare la stessa membrana, utilizzando una sonda che deve ibridizzare a un gene che so essere espresso nella stessa maniera in tutti i tessuti (cioè un gene housekeeping, sono geni non modulati) quali: proteine del citoscheletro (beta tubulina, actina..), GSPD (interviene nella glicolisi anaerobia).

    Quindi se ibridizzo con una sonda che lega l’actina, nella lastra io devo avere la stessa banda per tutti i pozzetti!
    27 MARZO

    ELETTROFORESI DELLE PROTEINE

    Tutte le tecniche che abbiamo descritto finora: sono usate per descrivere il singolo gene, o il singolo mrna.
    All’esame c’è sempre una domanda sull’elettroforesi (sui diversi tipi che facciamo).

    L’eletroforesi ha sempre lo stesos principio: è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido, per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso; in questo campo elettrico si spostano:



    • verso il catodo  le particelle cariche positive= cationi

    • verso l’anodo  le particelle cariche negative= anioni

    MOBILITA’ ELETTROFORETICA



    I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico comprendono:

    • la carica della molecola (q)

    • il gradiente di voltaggio del campo elettrico (E)

    • la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f)

    La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data dunque dalla seguente equazione:



    Comunemente è adoperato il termine mobilità elettroforetica (μ) dello ione, che equivale alla velocità dello ione diviso l’intensità del campo elettrico (v/E).

    Quando si applica una differenza di potenziale, molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loro mobilità elettroforetica.

    Anche molecole con carica elettrica uguale, ma con dimensioni molecolari differenti, si separeranno per effetto di forze frizionali diverse.


    APPARECCHIATURA PER ELETTROFORESI

    L’apparecchiatura usata per l’elettroforesi proteica (è la fig a dx) è costituita da:



    • ALIMENTATORE ELETTRICO

    • CELLA ELETTROFORETICA

    • SUPPORTO

    Quando faccimao un elettroforesi proteica: è un elettroforesi verticale (per il DNA e RNA era un elettroforesi orizzontale).
    MATERALI DI SUPPORTO

    Per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gel di poliacrilammide o di agarosio :



    • Per DNA e RNA  abbiamo usato un gel di AGAROSIO

    • Per le proteine  usiamo un gel di POLIACRILAMMIDE

    Come si prepara un gel di poliacrilammide:

    I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide, in presenza di piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide).

    La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (cross-linking agent, cioè un agente che fa fare cross-linking).


    (il successivo paragrafo non è da ricordare)

    Il processo di polimerizzazione dell’acrilammide è un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato e della base N,N,N’,N’-tetrametilendiammina (TEMED).

    Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioè una molecola con un elettrone spaiato), nel modo seguente:

    Se rappresentiamo il radicale libero con R· ed il monomero di acrilammide con M, possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente:

    R· + M → RM·

    RM· + M → RMM·

    RMM· + M → RMMM· ecc.
    In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dall’inserzione occasionale all’interno della catena di molecole di bis-acrilammide.

    Il gel di poliacrilammide che otteniao è molto idrofilico e trattiene grosse quantità di H2O.

    Domanda esame: Cosa facciamo se vogliamo separare le proteine? Un gel di poliacrilammide.


    ELETTROFORESI DENATURANTE/SDS PAGE

    L’elettroforesi che eseguimao per le proteine è detta DENATURANTE / SDS PAGE.

    Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche.

    Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente(sapone) Sodio Dodecil Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS.

    La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole proteiche per cui proteine più piccole si muovono più rapidamente attraverso il gel, mentre quelle con dimensioni maggiori sono più rallentate e migrano più lentamente (quindi le troveremo all’inizio del gel, più vicine a dove le abbiamo messe).


    Le proteine tendon a ripiegarsi su loro stesse. Quindi per permettere alla proteina di migrare in un campo elettrico, aggingiamo SDS che va proprio a depositaris sulla proteina e riesce a risolvere la conformaizone tridmenzionale della proteina e cosi le permette di migrare più facilmente/velocemente.





    Quindi per le proteine usiamo un gel di poliacrilammide e NON agarosio.

    Guarda la slide che mostra l’apparecchio dell’elettroforesi:


    • nella parte superiore troviamo uno stacking gel:

    ha una % fissa e serve per impacchettare i campioni diversi che noi poniamo; lo stacking gel infatti fa si che tutti i campioni arribino allo stesso livello (vedi la riga nera tra stacking e tank), da cui inizia la corsa che separa le proteine in base a carica, PM ecc.

    • e nella parte inferiore un separating gel: in cui le proteine corrono e sono separate.

    Caratteristiche di questa elettroforesi:



    • Separazione di proteine, preservando la loro attività biologica

    • Le proteine conservano la loro CARICA NATIVA (cioè la loro carica vera, naturale), si separano mediante le loro differenti mobilità elettroforetiche e gli effetti setaccio del gel

    ISOELETTROFOCALIZZAZIONE

    È sempre elettroforesi, ma in questo caso separa le proteine in base al loro PUNTO ISOLETTRICO (e non più sulla carica nativa come visto prima), quindi migrano in maniera diversa sulla base del loro punto isoelettrico.

    Caratteristiche:



    • Separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico

    • In un gel viene creato un gradiente di pH mediante l’aggiunta di appropriati anfoliti (sostanze che possono agire sia da base che da acido)

    • La miscela di proteine viene posta in un pozzetto sul gel e viene applicato un campo elettrico. Le proteine entrano nel gel e migrano fino a che non raggiungono un pH equivalente al punto isoelettrico

    • Le proteine con punti isoelettrici diversi si distribuiscono in punti diversi nel gel

    ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

    Quelle viste prima erano elettroforesi monodimensionali.

    Ora parliamo dell’elettroforesi bidimensionale.

    In questa viene fatta (sono le 2 elettroforesi viste prima) :


    1. prima una isoeletrocalizzaizone

    2. e poi viene fatta un elettroforesi su poliacrilammide (questo 2° passaggio viene detto: ‘separazione su seconda dimensione’).


    APPLICAZIONI DELL SDS PAGE

    • Analisi quantitativa delle proteine presenti nel campione di interesse:

    consieriamo una cellula normale e una cellula tumorale: vogliamo vedere se mRNA di myc è più presente nella cellula tumorale rispetto alla cellula normale.

    Per farlo facciamo: norhthern blot o PCR quantitativa o westernblot (vedi dopo)



    • Analisi qualitativa delle proteine presenti nel campione di interesse: lo posso fare mediante

    • colorazione con Coomassie o nitrato d’argento

    • o western-blotting




    • Determinazione del PM di proteine sconosciute:

    non conosco il PM delle proteine, e per saperlo faccio una elettroforesi
    TECNICHE DI RIVELAZIONE

    Nel gel di poliacrilammide abbiamo caricati nei vari pozzetti vari campioni (rivedi il monobidimensionale, verticale) e facciamo poi correre le proteine nel campo elettrico.

    Il gel dell’elettroforesi:


    • per il DNA: lo abbiamo colorato con bromuro di etidio e questo mi emette la fluorescenza quando metto il gel sotto gli UV

    • per le proteine invece: il gel lo coloro non con etidio, ma posso usare:
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