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29.03.2019
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coomassie briliant blu:

Il gel di poliacrilammide è immerso in una soluzione che contiene Coomassie Brilliant Blue R-250 sciolto in acido acetico diluito e metanolo. Rivela 0,1 mg di proteina.

Dopo questa colorazione, noi vediamo le proteine totali (vedi fig su) che hanno PM diversissimi tra di loro e quindi le vedremo come tante bande una vicina all’altra.



Il gel si colora con una miscela di sali d’argento e formaldeide.

Gli ioni d’argento reagiscono con i gruppi basici e tiolici delle proteine, in questa maniera le colorano (fig a giù).

Il silver è 100 volte più sensibile rispetto al coomassie, ed è efettuato quando vogliamo fare studi più approfonditi sulle proteine.
Anche qui dobbbiamo caricare dei marcatori quando faccimao un elettroforesi delle proteine, che corrispondo sempre a PM definiti.


WESTERN BLOT

Al termine della corsa elettroforetica, le proteine sono trasferita su un filtro di nitrocellulosa (o nylon) mediante una procedura definita elettroblotting, che avviene cosi:

Il gel (quindi usiamo lo stesso apparato dell’elettroforesi) e la nitrocellulosa sono posti in un apposito cestello a forma di sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due elettrodi paralleli (catodo e anodo).

La corrente, in direzione perpendicolare al gel, trasferisce le proteine dal gel  sul foglio di nitrocellulosa..

Ricorda che col southern e northern non applicavamo corrente, ma il trasferimento era per capillarità perché mettavamo concentrazioni di Sali; ora invece favoriamo il trasferimento usando corrente elettrica perché è la corrente che instauriamo che trasferisce le proteine sul foglio di nitrocellulosa.


Facciamo un westernblot proprio perché vogliamo studiare una proteina specifica: es quanta proteica di myc c’è nella cellula.

Proteina myc (trinagolo blu) è stata trasferita sulla nitrocellulosa insieme a tutte le altre proteine, ma noi vogliamo studiare solo proteina myc.

Per studiare myc noi usiamo una IG PRIMARIA (è la gialla. nella parte variabile abbiamo il determinate antigenico che si lega all’antigene) che è anti-proteina myc.

Ma quanta proteina myc c’è? Usiamo un metodo per visualizzare quindi quanta IG gialla si è legata alla proteina myc: per farlo usiamo ANTI-IG-CONIUGATO / IG SECONDARIO (è la verde. E’ di specie di ratto o coniglio. Si lega alla porzione costante della IG primaria) che possede legato un enzima: quando aggiungo il substrato dell’enzima, l’attività enzimatica emette luce e quindi la lastra viene impressionata e quindi vedimao il segnale.

Quello in fondo a dx è il risultato finale: vediamo ch enon è diversa da quelal che ottengo con Northern e Southern, però non usiamo più sistemi radioattivi ma una luce che impressione la lastra.
Per myc, posso usare come IG primaria:


  • IG monoclonali (si producono nel topo!)

  • IG policlonali (sono prodotti invece nel coniglio).

Che IG secondaria uso? Io devo ricordarmi qual è la specie del IG primaria che ho usato.

  • Se abbiamo usato un monoclonale di topo, dobbiamo usare una IG 2° di topo.

  • Se abbiamo usato una IG primaria policlonale di coniglio, dobbiamo usare una IG 2° di coniglio.

Perché se no la IG 2° di coniglio non legherebbe la IG 1° di topo e vice.
MICROARRAY

Abbiamo finito con le tecniche di base, ora iniziamo le tecniche dell’era post-genomica.

Microarray viene usata per un’analisi dell’espressione genica globale: è uno studio contemporaneo di tutti i geni.
Tutta la biologia molecolare è partita per comprendere la funzione biologica, è sempre partita dalla singola molecola per capire poi il fenotipo; dopo il sequenziamento del DNA e lo sviluppo di tecniche più sofisticate oggi studiamo la biologia in modo più complesso, infatti oggi non consideriamo il singolo elemento ma: studiamo tutte le proteine insieme, tutti gli mRNA della cellula, tutte le mutazioni della cellula.
Le tecnologie post-genomiche sono complementari tra di loro, e dovrebbero essere usate in parallelo per analizzare i fenomeni biologici complessi.
Cos’è un DNA microarray?

Un DNA microarray (comunemente conosciuto come gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro [i vetrini sono i più utilizzati], plastica, o chip siliconici.

I microarray sfruttano una tecnica di “ibridazione inversa”, consiste cioè nel fissare tutte le sonde su

un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico target.

Col northern vogliamo studiare es l’espressione di myc; che cosa abbiamo marcato in questo caso, cioè dove abbiamo il target? Sul filtro di nitrocellulosa abbiamo tutti i mRNA, e usiamo una sonda rappresentativa di myc.

Nel Microarray invece depositiamo sul vetrino TUTTO il genoma, e marchiamo mRNA che vogliamo testare (=il target).


DIFFERENTI TIPI DI MICROARRAYS

SINTESI FOTOLITOGRAFICA

Gli array che compriamo vengono sintetizzati mediante una tecnica detta fotolitografica perché la deposizione sfrutta la luce: è tramite la luce che depositiamo il DNA in posizioni determinate.

(non sapere i passaggi)

Ogni punto del vetrino, corrisponde a 25 nucleotidi di quel gene x 3; inoltre esistono altri 25 nucleotidi x 3 che presentano mutazione.





LETTURA DEI RISULTATI MEDIANTE SCANSIONE ED ALTA RISOLUZIONE

Mediante scansione ad alta risoluzione utilizzando un PC: cioè i segnali di ibridizzazione appaiono al pc come delle immagini chiaro-scuro ogni livello di chiaro-scuro viene associato a un numero, e questo ci permette una traduzione quantitativa.

I MICROARRAY SI POSSONO SFRUTTA PER DIVERSE APPLICAZIONI

L’applicazione dipende da cosa abbiamo sul Microarray:



COSA C’è SULL’ARRAY?

COSA METTIAMO SOPRA L’ARRAY? [cioè con cosa ibridizza]




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