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RAPPRESENTAZIONE DELLE VARIANTI GENETICHE (GENOTYPING



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RAPPRESENTAZIONE DELLE VARIANTI GENETICHE (GENOTYPING).

La genotipizzazione la valutiamo anche con fish e cariotipo.



Specifici frammenti di DNA (genotyping)

RAPPRESENTAZIONE DEL PROMOTORI (CHIP-ON-CHIP).

Se immunoprecipito i fattori di trascrizione isolo il DNA



Prodotti di ChIP (ChIP-on-chip)

Per studiare un profilo di espressione non userò mai un Northern, ma un Microarray.

Perché voglio studiare il profilo di espressione? perché :


  • Comprensione meccanismi patogenetici

  • Comprensione effetto farmaci

  • Classificazione clinica

  • Identificazione marcatori diagnostici

  • Identificazione marcatori prognostici

L’informazione genetica è uguale in tutte le cellule, e le varie cellule sono diverse per i vari profili di espressione perché presentano epigenetiche diverse.

Quindi noi vogliamo confrontare diversi tipi di espressione genica di: di 2 cellule normali, oppure normale-tumorale.


Come si studia l’attività di >30.000 geni contemporaneamente?

FACCIAMO UN EXPRESSION PROFILING SU CDNA MICROARRAY, ecco i passaggi:

  1. Estrazione di RNA dai campioni d’interesse: estraggo i trascritti da cellula normale e tumorale, perché voglio confrontare i profili di espressione di queste 2 cellule

  2. Trascrizione inversa in cDNA, incorporando nucleotidi marcati con fluorocromi di colore rosso e verde:

cosi possiamo sovrapporre le immagini e visualizzarle.

  1. Parallelamente produzione del Microarray

  2. Ibridazione del Microarray con cDNA marcato

  3. Lettura dell’immagine:

col Microarray otteniamo un pannello colorato (vedi fig).

  • rosso e verde una volta sovrapposti danno un’immagine gialla: quindi se otteniamo giallo significa che l’espressione degli geni in cellula normale e tumorale è uguale

  • se troviamo solo verde o rosso questi riguardano geni che si comportano in maniera diversa da normale a tumorale.

  1. Analisi dei dati.

Dobbiamo convertire l’immagine del Microarray in una serie di numeri in base all’intensità del segnale, e dare un nome ai geni:

  • la cui espressione è aumentata (si dice che sono upregolati)

  • oppure espressi nella stessa maniera

  • oppure espressi di meno (down regolati)

 cosi capiamo la differenza dei profili di espressione tra 2 cellule normali, o cellula normale-tumorale:

es vediamo che il gene fos è più espresso nella tumorale, allora vogliamo capire come e perché viene iperespresso.

Quindi:


  1. prima facciamo un’analisi assoluta

  • Calcolo e sottrazione del background: con la sonda presentante le mutazioni

  • Calcolo del valore quantitativo e qualitativo (presente-assente-non valutabile)

  1. poi un’analisi comparativa

  • Normalizzazione dei dati dei 2 microarray o delle 2 scansioni

  • Calcolo del rapporto dei valori di segnale nei 2 campioni, quantitativo e qualitativo (aumentato-diminuito-invariato)


3 APRILE


Abbiamo detto che con l’array abbiamo molti dati.

L’immagine finale è a colori: rosso, giallo, o sfumature di grigio  vengono convertiti in numeri.

Quindi facciamo:

1)analisi assoluta

-valutiamo se il segnale è presente-assente- o non valutabile.

2)analisi comparativa

Perché lo scopo del array è proprio il confronto.
DISEGNO SPERIMENTALE

1)ANALISI COMPARATIVA:

significa confrontare un campione patologico con un campione normale.

O un campione con trattamento farmacologico e un campione non tratta: vogliamo confrontare il profilo di espressione dei 2 campioni.

2)ANALISI DI RAGRUPPAMENTO:

è per questo tipo di analisi che sono stati usati gli array. L’obbiettivo è identifica.. slide.


1)ANALISI COMPARATIVA/di confronto

Legge


Quindi io voglio confrontare i profili di espressione di 2 tipi cellulari diversi.

Disegno sperimentale: cioè come noi decidiamo di approcciare il problema.


DIETNFIICAZIONE DI MARCATORI

Istologia del tumore, stazione del tumore, risposta al farmaco.

Legge
Slde sequendo questo approprio.. slide.

I profili di espressione sono stati utili per identificare nel tumore della mammella, un sottotipo molecolare nuovo.

Per tumore mammaria: si effettua biopsia e successivamente diagnosti istologica; nella diagnosi indichiamo anche il SOTTOTIPO istologico (il tipo istologico). I profili di espressione, nel ambito dello stesso tipo tumorale, hanno identificato die sottotipi molecolari: importanti perché a quel sottotipo molecolare (quid un raggruppamento di persone) va fatto una terapia diversa oppure ha una prognosi diversa.

Quindi lo studio dei profili di espressione è importante per la classificazione e diagnosi del tumore.

Diciamo sottotipi ‘molecolari’: perché ci riferiamo a un gruppo di geni contemporaneamente, usando il Microarray.
Slide moelculrar classficiation

Vediamo il risultato di un array: vediamo che l’espressione di tutti questi geni ci ha permesso di classificare le leucemie: di tipo linfoblastica da una mieloblastica.

Rosso=indica iperespresso.


  • Gi fu: vediamo che quel gruppo di geni rossi, è più espresso nella linfoblastica;

  • fig giù: quei geni rossi sono più espressi nella mieloblastica.

E questi 2 tipi di leucemie, che iperesprimono geni diversi: necessitano di trattamenti diversi.
Lo studio dei profili di espressione: è stato usato anche a scopo di prevenzione, per prevedere es lo sviluppo del tumore alla mammella.
ELABORAIZNE DI RISULTATI

Ci sono specifiche funzioni che sono bersagliare nei campioni di analisi?

Prima abbiamo visto lo studio dei profili di espressione dal punto di vista clinico; ma è molto utile anche nell’ambito della ricerca: se vediamo che la cellula tumorale esprime di più o meno quel gruppo di geni, vogliamo sapere se quel gruppo di geni va a modificare la stessa via di segnalazione; cioè quando studiamo il profilo di espressione noi abbiamo un risultato che non coinvolte la modificazione di un singolo gene quindi non stiamo studiando una singola funzione, quindi noi ci chiediamo se tuti questi geni che vediamo iperespressi regolano una via di segnalazione specifica comune all’interno della cellula (es vediamo 5 geni iperespressi: ci chiediamo, sono coinvolti tutti nella proliferazione cellulare?).
Abbiamo detti che le nuove tecniche ci danno molte informazioni, il problema è interpretarli tutti.

Vogliamo capire se un tot di geni appartengono alla stessa via di segnalazione.


SLIDE RIASSUNTO

legge


ANALIS COMP: sono le più semplici.

Metodiche diverse: la PCR quantitativa ci dice se la variazione è vera, e quindi vogliamo capire se questi geni iperespressi regolano una funzione comune e qual è questa funzione comune. Per raggruppare i geni in maniera funzionale si utilizzano dei macchinari.


Slide

Una volta identificati i geni di nostro in..legge.

1)Quand facciamo un microarray, noi analizziamo l’interno trascrittoma; ma se vogliamo fare ulteriori studi possiamo creare microarray/chip più piccoli che contengono solo geni selezionati, sono più economici e maneggevoli.

Es: inizialmente abbiamo fatto un profilo di espressione globale, e abbiamo trovato nel tumore al polmone 25 geni modificati e ci permettono di diagnosticare un sottotipo; e per capire come nella popolazione si distribuisce questo sottotipo molecolare facciamo un Microarray che analizza solo questi 25 geni.

2)hig-throughput= cioè ad ampia larghezza. Sono tecniche alternative al chip. Min 25

La PCRq: prevede la possibilità di poter analizzare 96 geni insieme.


Slide vantaggi e svantaggi

La PCR valida perché è alternativo. Costa perché abbiamo bisogno di 1 taqman per ogni gene.


Slide CARCINOMA MAMMARIO

I profili di espressione genica sono stati utili per classificare il tumore alla mammella in sottotipi: parliamo di diagnosi molecolare.

A sx sono riportati i geni modificati.

Vediamo che è stato possibile identificare un fenotipo novo (detto basal like): perché presenta geni iperespressi (macchia rossa), che sono meni espressi in altri sottotipi.

E questo basal like ha un trattamento farmacologico e prognosi completamente diversi rispetto ai tipi: lobulare e duttale.

Prognosi diversa:



  • il progression free survival (PFS) ci dice quanto tempo dopo il trattamento la persona riesce a vivere senza malattia. Quando compare la recidiva, il PFS termina.

  • Esiste anche un altro parametro min 32

Lo studio dei profili di espressione ha generato un grande numero di informazioni: anche molto discordanti tra di loro, perché sono stati utilizzati:

-popolazioni di studio differenti: se studio le pz con tumore alla mammella in 2 gruppi in cui in ciascuno le donne hanno età diverse, oppure di razza diverse (che hanno polimorfismi diversi). Quini lo studio dei profili di espressione va analizzato in maniera critica.
Slide neu england

I profili di espressione genica on risultano immediatamente informativi..

Cioè i risultati di questi studi devono essere validati in centri diversi e in diverse parti del mondo.
Slide 6 febbraio

Il 6 febbraio del 2007 è stato reso pubblico il primo test di espressione genica approvato per la diagnostica. Predice il rischio di tumore alla mammella in tempi precoci: usa i livelli di espressione di 70 geni per valutare il rischio di caduta, perché le pz che li esprimono hanno un rischio elevato di recidiva, quelle che non lo esprimono hanno rischio basso.

La pz con rischio alto deve rifare la mammografia più frequentemente rispetto alla pz con basso rischio, dovrà pure prendere farmaci differenti.
TISSUE MICROARRAYS

Ci dice 2 cose.

È sempre un’analisi su larga scala.

Sul vetrino, invece di avere DNA, o i fattori di trascrizione ecc: questa volta abbiamo tanti tessuti, quindi facciamo una immunoistochimica. Sul vetrino ogni pallino corrisponde a un tessuto/tumore diverso: lo chiamiamo tissue proprio perché sul vetrino abbiamo la rappresentazione di TANTI tessuti ( che possono essere tanti tumori) e non solo 1; a seconda che i tessuti siano normali o tumorali, faremo un tissue microarray normale o tumorale.


IMA

Il tessuto viene incluso in paraffina.

Abbiamo un blocchetto, e possiamo fare tanti vetrini: in ogni vetrino è rappresentato 1 tessuto.

Con un tissue microarray invece, ogni punti del vetrino è rappresentativo di un tessuto: praticamente mettiamo tanti blocchetti su un singolo vetrino (vedi figura slide). È un hig-throuhg put analisi: cioè analisi su larga scala.


COSTRUZIONE DI UN TMA

Riassunto dei passaggi per costruire un tissue microarray.


STEP 1

Possiamo fare diversi TMA a seconda della domanda a cui vogliamo rispondere.

TMA di progressione: possiamo valutare in maniera rapida in quella fase della malattia è espresso il marcatore che stimao studiando, perché sul vetrino abbiamo i vaei tessuti che rappresentano i vari stadi dela malattia.

Es nel tumore dle colon retto: usiamo un vetrino che contiene  polipo, ipertrofia, tumore ecc.


STEP 3

Vediamo che un gene è espresso in A1,A2 ecc ma non in A3.

Quindi capiamo se un gene specifico è espresso o meno nei vari tessuti dell’organismo.
CHE COSA SI IBDIRIZZA NEL TMA?

-rna marcato: parliamo di ibridizzazione in suto (ISH)

-se usiamo una IG: è una tecnica di immunoistochimica (IGC); cioè una tecnica che usa IG specifica per la proteina che vogliamo studiare nel tessuto.
I vantaggi della TMA:

-legge
TMA MULTITESSUTO

Cioè usa tessuti diversi dell’organismo.

Stabiliamo rapidamente in quali tessuti dell’organismo quella proteina o IG è espressa.


TMA DI PROGRESSIONE

Vediamo che es il marcatore A ibridizza solo nei carcinomi.


TISSUE VS MICROARRAY

TMA può essere utile come approccio complementare.

Col microarray valutiamo i profili di espressione, e i risultati li validiamo con un TMA.
NUOVE SLIDE SANGER

METODO DI MAXAM E GILBERT

È un metodo obsoleto non più utilizzato. Era stato utilizzato all’inizio, non è enzimatico (cioè non è di sintesi, non usa la DNA pol) mentre quelli attuali sono di sintesi del DNA (quello attualo è il sanger).

Nel sanger noi conosciamo la sequenza nucleotidica polimerizzando il DNA.

Il metodo di maxam era un metodo che utilizza una degradazione chimica dle DNA: parte dal DNA a singolo filamento marcato con fosforo al 3’, poi si modificano delle basi e vengono usate sostanze chimiche (anche cancerogene) che frammentano il DNA in maniera casuale mediante una degradazione chimica.

Quesit frammenti di dna a doppio filamenti vengono convertiti a singolo filamenti, e vengono marcati: dopo di chè sono caricati sul gel di poliaclimmadie e visualizzati mediante autoradiografica.

Poi questi frammenti di DNA vengono separati mediante elettroforesi vrticale del dna usando gel di poliacrilammide.

Slie questo metodo ecc legge

Si usa il DMS che modifica il DNA, e poi la piperidina spezza.legge slide marcatura
Ricorda questo sul maxam:

Non enzimatico, è chimico che uso sostanze tossiche, epoi si aggiunge la piperidina che taglia il dna a frammento a singola catena che sono caricati su gel di poliacrlimmaide e viene fatta un autoradiografia.


Slide

In the 1970

Il metodo usato largamente è il metodo Sanger.

È stato inventato da sanger che ha ricevuto il nobel nel 1980, perché ha inventato questo metodo per sequenziare il DNS che si distingue dagli altri metodi perché utilizza nucleotidi particolari detti TERMINATORI DI CATENA che sono DIDEOSSINUCLETODI.


Slide klenow

È un metodo a terminazione di catena. Ha scoperto che poteva modificare i 4 nucleotidi e oltre a questi poteva usare anche un terminatore di catena che è il dideossinucleotidce.

Questo sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA: quindi non è un metodo chimico, ma è un metodo di sintesi.

Questi filamenti sono complementari al filamento stampo, che è quello di cui vogliamo conoscere la sequenza ; per conoscerla dobbiamo polimerizzare una nuova catena, quindi lo stampo deve essere a singolo filamento.

Per la sintesi deve usare: DNA pol, detta o klenow o sequenasi, con 3 caratteristiche: slide.
Nel sequenziamento a terminazione di catena, la reazione oltre a uno stampo a singola elica, ha bisogno anche di un innesco(primer), perché altrimenti la dna pol non polimerizza.

Inoltre abbiamo bisogno anche di 4 deossinucleotidi, e almeno uno dei 4 o il primer deve essere marcato, una volta si marcava con fosforo radioattivo e successivamente invece si è usato lo zolfo35. Il fosofro radioattivo necessita di schermi per proteggerci dalla radiazione, inoltre ha emivita più breve; per lo zolfo non serve lo schermo percè la plastica del eppendrof impedisce l’emissione della radioattività, quindi è più maneggevole per marcare i nucleotidi.


Sldie sintesi

La sequenza nera è quella che vogliamo conoscere.

Se marchiamo la G, quando questa verrà incorporata vedrò la marcatura.
Sanger inoltre ha inventato l’aggiunta di terminatori di sequenza.

Quindi oltre ai deossinucleotidi normali (i 4), si aggiungono anche DIDEOSSInucleitidi trifosfato: uno per ogni reazione di sequenza, e si chiamano terminatore di catena: sono identici ai nucleotidi normali ma in posizione 3’ manca l’ossigeno.

Vedi nella slide i 4 dideossi.

Sono detti terminatori perché quando la pol incorpora il dideossi, la polimerizzazione della catena si blocca: quindi noi sappiamo che dove si blocca, nel filamento complementare c’era una C (perché trovo il dideossi G).


I Dntp hanno un OH al 3’ per aggiungere altri nucleotidi, il dideossi no e per questo è un terminatore di sequenza.

Per ogni base nucleotidica (i 4) noi mettiamo il dideossi complementare.


Dobbiamo dividere in 4 provette i 4 terminatori:

  • -I una mettiamo il terminatore A (ne mettiamo tanti)

  • -mettiamo il terminatore C

  • -

  • -

In ogni provetta, mettiamo la STESSA MSICHELA DI REAZIONE (che contiene: dna pol, i nucleotidi..).

Il risultato è una serie di frammenti interrotti in corrispondenza di ogni dideossinucleotidce.

Nella provetta 1: vediamo tanti frammenti che terminano tutti con dideossi A.
Tutti questi risultati, li carichiamo su gel di poliacrilamide perché sono frammenti piccoli, e facciamo una elettroforesi verticale.

Con l’autoradiografia si crea una lastra in cui identifichiamo bande: leggiamo la sequenza dal basso verso l’alto.

Una volta le bande erano lette manualmente.
Il nuovo metodo si basa sempre sul principio di sanger, ma non è più manuale. Non utilizza più l’elettroforesi usando un gel di poliacrilamide, ma utilizza une elettroforesi capillare: cioè carica i vari campioni in un capillare e questo capillare viene colpito da un sistema di luce, e viene tradotto ciò che vinee corso all’interno del capillare in un tracciato detto elettroferogramma che presenta picchi, e ogni picco corrisponde a una base.

Inoltre si usano terminatori di sequenza a cui vengono legati sostanze fosforescenti (al posto della sostanza radioattiva. Quindi le sostanze fosforescenti sono i marcatori), quindi abbiamo l’emissione in picchi.

Salta molte slide

Dye temrinator

I frammenti si distinguono: in base a dimensione e colore (perché emettono fosforescenza diversa).
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi i colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Ogni picco corrisponde a una base.


Slide sequenziamento automatico

Quindi le sostanze fosforescenti emettono emissioni, che la macchina traduce in picchi.


10 APRILE

AUTOMATED SANGER METHOD

Metodo NGS / next generation sequencing  sono i metodi di sequenziamento di nuova generazione; questi test poi vengono confermati con il metodo sanger [che è un test di 1° generazione], cioè confermiamo ciò che abbiamo sequenziato coi NGS utilizzando il metodo Sanger.

Il metodo sanger è utilizzato in tutto il mondo.


SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

Si usano diverse piattaforme per i NGS.

Per ogni azienda esiste una modalità diversa di sequenziamento, e per ognuna esistono vantaggi e svantaggi sia in termini di costi di sequenziamento che di risultati di sequenziamento.

ILLUMINA/SOLEXA: è la piattaforma più utilizzata in tutto il mondo, quindi i dati NGS pubblicati su diversi lavori scientifici si basano soprattutto su questa piattaforma.

Poi esistono anche altre piattaforme.
Non dobbiamo ricordare le informazioni nei dettagli noi, dobbiamo sapere i principi generali (es che sanger usa i dideossinucletidi ecc).
Domande attuali di tutti i laboratori del mondo e dei centri clinici sono: quali sono le mutazioni dei pz affetti da es tumore polmonare? E qual è la frequenza di queste mutazioni nella popolazione?

Il metodo Sanger è lungo, costoso: quindi non lo utilizziamo sui 300 pz, ma su questi usiamo i NGS.

I vari centri clinici si uniscono per decidere di sequenziare il genoma di un gran numero di pz.

Alleanza contro il cancro: è un insieme di ospedali in tutta Italia, che hanno creato questa alleanza con l’obbiettivo di raccogliere i vari tipi di tumori in tutta Italia; questi centri raccolgono campioni di tessuto, e li conservano:



  1. in blocchetti paraffinati

  2. oppure questi tessuti vengono congelati

questi campioni poi vanno centralizzati e sequenziati coi NGS: solo con questi metodi tramite le piattaforme es illumina io rilevo quali sono le mutazioni che identifico in un determinato gruppo di pz rispetto a un altro gruppo di pz  questo è il sequenziamento di ultima generazione.
I NSG si basano sul principio del sequenziamento di 'cluster' clonali: cioè noi abbiamo frammenti di DNA [perché una volta isolato il DNA lo abbiamo frammentato] e per ogni frammento produciamo vari cloni [sono i cluster clonali]

 i vari cloni li produciamo con la PCR di modo che ogni frammento sia rappresentato miliardi di volte [= parliamo di amplificazione clonale]



Copie multiple identiche sono infatti necessarie per avere un alto rapporto segnale-rumore, quindi per avere un risultato che si altamente specifico.
SEQUENZIAMENTO SANGER

Perché il progetta genoma ha impiegato 12 anni per sequenziare il genoma e come hanno fatto ?

Oggi abbiamo metodi per sequenziare il genoma in 1 gg e i costi sono di 350 euro a campione (una volta era biliardi di dollari).

Nel progetto genoma si è usato il metodo Sanger: è un metodo ad alta processività, e nonostante abbiano usato dei robot ci hanno impiegato 12 anni.



Analizzando i vari passaggi del sanger, capiamo perché ci hanno impiegato 12 anni:

  1. frammentazione casuale del DNA genomico. Come si frammenta il DNA? Con enzimi di restrizione, oppure usiamo metodi fisici quali ultrasuoni (ricorda il sonicatore: basta avere una provetta con del DNA, e con gli ultrasuoni il DNA è frammentato).

  2. a questo punto dobbiamo clonare ogni frammento nei batteri, e quindi trasformare i batteri.

  3. Poi dobbiamo identificare le colonie di batteri

  4. Le colonie poi vanno purificate e sequenziate col metodo sanger.

Col sanger non usiamo più metodi di sequenziamento manuale: con manuale intendiamo elettroforesi + radiografia.

Ma col sanger si usa una elettroforesi capillare e otteniamo poi un elettroferogramma: con l’elettroferogramma ho diverse frammenti da cui poi devo ottenere un frammento unico.


Ogni lettura viene chiamata read.

Le reads sono la lettura del singolo frammento: di ogni frammento ricorda che abbiamo molti cloni [ottenuti con PCR]. Il sequenziamento è più efficace se noi otteniamo più reads, perché abbiamo più letture dello stesso frammento e quindi abbiamo più possibilità di ottenere un informazione corretta.


Gli ADATTATORI: sono sequenze che vengono ligate ad ogni frammento del DNA indipendentemente dalla sequenza del frammento di DNA.

La dna pol ha bisogno del primer e noi mica conosciamo la sequenza del frammento [visto che noi vogliamo appunto sequenziarlo per scoprirla], quindi non possiamo usare degli oligonucleotidi: ma USIAMO QUESTI ADATTORI UNIVERSALI che ci permettono di fare una PCR su frammenti di cui non conosciamo la sequenza.


VANTAGGI DELLE PIATTAFORME DI NSG

  1. I NGS cosa hanno permesso di abolire? Hanno abolito il clonaggio nei batteri!

Frammentiamo sempre il DNA, ma coi NGS amplifichiamo i frammenti con la PCR [e non più trasformando i batteri]!

Questa è la grande differenza tra sequenziamento di vecchia e nuova generazione.



  1. Rivoluzionaria diminuzione del costo e del tempo per generare dati di sequenza: perché i dati sono prodotti in parallelo al lavoro.

SVANTAGGI DELLE PIATTAFORME NSG



  1. Coi NGS possiamo sequenziare frammenti più corti rispetto ai frammenti che possiamo sequenziare col metodo Sanger. Col Sanger sequenziamo un frammento di 600-500 basi.

  2. Per ogni corsa, vengono prodotti da 10 gb a diversi tb di dati grezzi [che sono molti].

Bisogna quindi avere strutture bioinformatiche adattate per interpretate i dati che vengono prodotti; inoltre ci vuole la capacità di un bioinformatico per interpretare tutte queste reads.

Ricorda che ogni read [i frammentini della figura sù] ce l’abbiamo n volte, noi dobbiamo mettere queste reads in ordine ed assemblarle di modo da ottenere una sequenza unica [vedi figura] per valutare se questa sequenza unica è portatrice di una mutazione, e dobbiamo essere sicuri di ciò che comunichiamo al pz.

Per analizzare questi dati ho bisogno di molta memoria sul pc, e la memoria costa molto; quindi abbiamo bisogno di un bioinformatico che sia bravo e che possieda anche la strumentazione adatta.
La tecnologia è in continua evoluzione: man mano coi NGS riusciamo a sequenziare sequenze sempre più lunghe.
RISEQUENZIAMENTO

Il bioinformatico usando delle pipline specifiche deve assemblare queste piccole sequenze, usando una sequenza di riferimento. Noi conosciamo la sequenza di rifermento, ottenuta nel 2000 col progetto genoma; se non abbiamo la sequenza di riferimento non riusciamo se no a riassemblare tutte queste reads.

Supponiamo di voler sequenziare il genoma di un pz con tumore al polmone perché voglio valutare se presenta una mutazione; non uso il Sanger, al massimo lo uso per risequenziare la sequenza in cui ho trovato la mutazione per validare la mutazione che ho trovato, perché se usassi il Sanger fin dall’inizio ci impiegherei troppo tempo.

Isolo e frammento il DNA, e poi questi frammenti li devo riallineare usando il genoma di riferimento, per ottenere una sequenza unica.

Per capire se il genoma è mutato: faccio biopsia del tumore del polmone e ne estraggo il DNA; dopo di ché sequenzio il DNA col NSG; non usiamo il genoma di riferimento pubblicato nel 2000 ottenuto da 1 pz, ma usiamo il genoma del pz di cui vogliamo studiare il tumore; il DNA lo prendiamo dal sangue del pz e questo rappresenta il suo genoma normale! Poi confrontiamo il ‘DNA del tumore’ col ‘DNA prelevato dal sangue’ [questi 2 DNA sono entrambi del pz!]  cosi identifichiamo le mutazioni presenti nel tumore.

Abbiamo bisogno del DNA del pz, perché vogliamo capire se la mutazione è SOMATICA o un POLIMORFISMO presente dalla nascita (in quest’ultimo caso diciamo GERM-LINE).

Mutazioni SOMATICHE: cioè acquisite DOPO la nascita del pz (altrimenti se fossero germ-line avremmo le mutazioni in tutto il nostro DNA).

PAIRED-END [PE]

Tutte le piattaforme next-generation offrono la possibilità di produrre ‘paired-end-read’, cioè la sequenza può essere derivata da ciascuna delle due estremità di ogni frammento della libreria.

Esistono differenze nella distanza tra le due read pair-end, basate su un diverso approccio/piattaforma.

In generale, le reads paired-end offrono vantaggi che dipendono dalla complessità del genoma e dall’applicazione/tipo di esperimento.

PDF ILLUMINA  è la piattaforma più utilizzata. VEDIAMO I PASSAGGI:





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