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TEMPLATE PREPARATION:

frammentazione del DNA.

Il templato include il DNA da sequenziare ligato a delle sequenze adaptor a cui si legano dei primer universali.



  1. IL TEMPLATE E’ ATTACCATO o immobilizzato su una superficie solida o un supporto permettendo cosi’ di fare milioni di reazioni di sequenza contemporaneamente.

Abbiamo vetrini con delle camerette su cui è immobilizzato il template frammentato legato a questi adattatori universali.

  1. AMPLIFICAZIONE CLONALE DEL TEMPLATO per amplificare il segnale fluorescente.

Abbiamo la formazione di cluster di cloni di DNA spazialmente separati [cioè i diversi cloni che otteniamo con la PCR amplificando i diversi frammenti, restano separati in cluster e non mescolati. 1 cluster=insieme dei cloni di 1 frammento].

  1. Il sequencing si basa sul CYCLIC REVERSIBLE TERMINATION: è un metodo ciclico che comprende:

  1. l’incorporazione di nucleotidi fluorescenti [è un nucleotide legato a una sostanza fluorescente]

  2. l’imaging della fluorescenza [cioè visualizziamo la fluorescenza su un immagine]: per determinare l’identita’ dei nucleotidi incorportati

  3. il clivaggio: rimozione del gruppo terminante e del colorante fluorescente

  4. lavaggio

  5. ricomincia un nuovo ciclo: cioè l’aggiunta di nuovi nucleotidi fluorescenti (si legherà uno dei 4 nucleotidi).

A differenza del Sanger che usa terminatori irreversibili [cioè una volta incorporato il dideossinucleotide la sintesi termina], nei NGS è usato un metodo ciclico che prevede l’incorporazione di nucleotidi fluorescenti: quindi il nucleotide che viene incorporato è colorato con la sostanza fluorescente (i 4 nucleotidi hanno colori diversi). La fluorescenza poi è trasmessa.

Quindi: nucleotide incorporato + fluorescenza  emette la fluorescenza  poi stacchiamo questo nucleotide + la sostanza fluorescente  poi si incorpora un nuovo nucleotide con un'altra fluorescenza e cosi via [è il ciclo. I nucleotidi sono messi e staccati uno alla volta]. Per questo parliamo di terminatori REVERSIBILI: perché una volta incorporato poi viene rimosso.


I NSG danno meno falsi positivi se viene usato del materiale congelato: cioè prendo un pezzo di tumore e lo congelo subito a meno 80°; un altro pezzo di tumore è conservato con paraffina per utilizzarlo per fare una tecnica immunologica per capire se sono espressi determinati antigeni [rivedi prima].

Il problema è che quando facciamo una biopsia al soggetto, il materiale biologico non è tanto: questo materiale è usato per:



  1. lo usano i laboratori che effettuano colture primarie per valutare la resistenza ai farmaci

  2. un altro pezzo è paraffinato

  3. e un altro pezzo viene congelato.

In passato il tessuto non veniva congelato, quindi i risultati che abbiamo oggi contengono molti falsi positivi [per falsi positivi intendiamo che: consideriamo una sequenza come mutata quando in realtà non lo è; questo può avvenire perché il materiale non congelato non è conservato adeguatamente e quindi altera la sua sequenza].
Sequenziare solo l’esoma invece dell’intero genoma: riduce costi e tempi. Ha permesso di stabilire la patogenesi in diversi disordini quali tumorali.
Il sequenziamento di ultima generazione è stato importante anche per capire meccanismi cellulari.

Oggi viene fatto un High-throughput RNA sequencing (High-throughput = cioè su larga scala).

Oggi il microarray non è più usato perché coi NSG siamo in grado di sequenziare tutti gli mRNA della cellula [appunto in modo: High-throughput].

I vantaggi della RNA-sequencing [=RNA-seq] sono che:



  • risponde alle stesse domande dei Microarray (cioè stabilire quali sono i trascritti più espressi e meno espressi),

  • e in più, oltre all’informazione quantitativa, l’RNA-sequencing ci fornisce anche un’informazione qualitativa. Il Microarray ci fornisce invece solo un’informazione quantitativa: l’informazione quantitativa del microarray è fornita dall’intensità di fluorescenza.

L’RNA-sequencing ci fornisce anche un’informazione qualitativa perché ci permette di conoscere anche la sequenza del mRNA [il microarray invece non ci fornisce la sequenza del RNA, ma ci dice solo quanto di quel RNA c’è tramite il segnale di fluorescenza] quindi possiamo capire se esistono splicing alternativi, traslocazioni ecc;

quindi per uno studio di larga scala di espressione si usa l’RNA-sequencing e non più il Microarray.



  • Un altro vantaggio della RNAsequencing è che: sequenzia anche miRNA e altri RNA non codificanti.

CHIP-SEQUENCING

La CHIP: è l’immunoprecipitazione della cromatina usando IG-anti istoni.

Serve per poter sequenziare le sequenze che vengono legate dai fattori di trascrizione [e non le sequenze dei fattori di trascrizione].

Noi possiamo far precipitare quella cromatina usando IG-antistoni che si legano alla cromatina.

Il DNA precipitato lo stacchiamo e lo sequenziamo: facciamo una chip-sequencing, cioè sequenziamento della chip.


Single-cell exome: le cellule del tumore non sono tutte uguali, quindi possiamo valutare le mutazioni a livello della singola cellula, per capire l’eterogeneità del tumore.


Una volta trovata la mutazione, devo dire a quale fenotipo porta.
Oggi la medicina è diventata personalizzata: in base al genoma del pz, posso capire se il farmaco è tossico o meno per questo pz  questo ha determinato la nascita della FARMACOGENOMICA.

26 APRILE

FARMACOGENOMICA

OBBIETTIVI DIAGNOSTICI IN ONCOLOGIA



Stadiazione: della prognosi.


1)CLASSIFICAZIONE DEI PROFILI DI ESPRESSIONE GENICA

La genomica viene usata per una CLASSIFICAZIONE MOLECOLARE dei tumori.

Es nel tumore alla mammella: studiamo i profili di espressione genica  una volta si faceva usando il Microarray, oggi il Microarray è sostituito dal RNA-sequencing [fatto con le tecniche di lumina].

L’RNA-sequencing ha vantaggi notevoli rispetto al Microarray: perché ho un’info non solo quantitativa [cioè quanto quegli mRNA sono espressi in un dato campione rispetto a un altro], ma essendo un sequenziamento ho anche un’informazione qualitativa [e dunque posso identificare splicing, proteine di fusione, riarrangiamenti ecc].

Vediamo l’analisi fatta al pc:


  • rossi=più espressi [intendiamo ‘i geni’ più espressi]

  • verdi=meno espressi.

Lo studio dell’espressione genica ha identificato una nuova classe molecolare nei tumori alla mammella, che non era mai stata identificata con studi istologici: è il BASAL LIKE.

2)PROFILI PROGNOSTICI

Cioè a una determinata classe molecolare [che corrisponde a un particolare profilo di espressione], corrisponde una prognosi diversa: più favorevole o meno.
La letteratura sulla genomica può dare risultati discordanti: questo perché


  • i campioni non sono omogenei fra di loro

  • le varie aziende usano piattaforme diverse

Oggi la RNA-sequencing ha aiutato a risolvere questi problemi di dati discordanti.
3)TERAPIA-FARMACOGENOMICA

È una nuova branca nata dalla genomica, è un’applicazione della genomica.



La farmacogenomica è una scienza che studia le variazioni genetiche dei geni che determinano la risposta ai farmaci, ed esplora la possibilità di usare tali variazioni, per prevedere se un pz trattato con un farmaco avrà una risposta: soddisfacente, scarsa, o nulla.

La farmacogenomica dunque vuole prevedere se A QUEL DETERMINATO PZ [quindi non parliamo dell’insieme dei pz con quella determinata malattia, ma ci riferiamo al singolo pz] , il farmaco produrrà un effetto favorevole o sfavorevole; questo perché la maggior parte dei farmaci vengono metabolizzati nel organismo, e cioè trasformati in composti più attivi, e il gene responsabile della codifica dell’enzima che metabolizza il farmaco può essere un gene mutato o che ha qualche alterazione  quindi nella popolazione possono esistere dei polimorfismi, che sono appunto responsabili della risposta diversa alla terapia.


Tumore alla mammella: il farmaco elettivo somministrato alla maggior arte delle pz è il tamoxifene, sono pz estrogeno-positive.
CYP2D6

Il CYP2D6 è un membro della superfamiglia enzimatica citocromo p450: questa famiglia



Molte sostanze vengono bioattivate dal CYP2D6 per formare i loro principi attivi: cioè noi introduciamo la sostanza in forma inattiva, e il CYP2D6 la metabolizza e cosi la trasforma in un composto atti o [si dice appunto ‘bioattiva’]; un esempio di sostanza bioattivata è il tamoxifene.

CYP2D6 è coinvolto nella ossidazione [e quindi bioattivazione] di una vasta gamma di substrati di tutti i citocromi [cioè questi substrati rappresentano i substrati di tutti i citocromi].


VARIAZIONE GENETICA DEL CYP2D5

CYP2D6 è importante per la bioattivazione del tamoxifene, e un soggetto può avere mutazioni del gene CYPD6 quali:



  • Delezione genica

  • Duplicazione genica (anche di diversi alleli)

  • Sostituzioni nucleotidiche (anche multiple)

  • Delezioni di singoli o molteplici nucleotidi

  • Inserzioni/ripetizioni di singoli o molteplici nucleotidi

  • Polimorfismi del promotore

IL GENOTIPO HA UN EFFETTO IMPORTANTE SUL METABOLISMO DEI FARMACI

A seconda del genotipo, abbiamo una risposta efficace o meno ai farmaci.

Vediamo diversi tipi di soggetti: SOGGETTO



  • ULTRARAPID:

è un soggetto che possiede MULTIPLI ALLELI FUNZIONALI, che gli consentono di avere un metabolismo ultrarapido, quindi il farmaco diventa rapidamente inefficiente [nel senso che lo bioattiva tutto subito, e dunque poi non ne resta più].

  • EXTENSIVE:

è un soggetto con ALMENO UN ALLELE FUNZIONANTE.

con la presenza di alleli nulli, vediamo che gli effetti avversi aumentano.



  • INTERMEDIATE:

un allele con attività ridotta e un allele nullo.

Con la presenza di alleli nulli, vediamo che gli effetti avversi aumentano.



  • POOR:

2 alleli nulli.

Questo soggetto presenta solo effetti avversi e non terapeutici [perché non avendo alleli funzionali, non bioattiva il farmaco].

Quindi se conosciamo il genotipo della persona, sappiamo quale sarà la risposta se diamo il tamoxifene: perché in base al polimorfismo avrà più o meno sostanza attiva in circolo.

Quindi se vogliamo operare una medicina personalizzata per pz con tumori alla mammella, dobbiamo conoscere il genotipo del CYPD6.


IL TAMOXIFEN

Il composto attivo del Tamoxifen è chiamato ENDOXIFEN: quindi il CYPD6 trasforma il Tamoxifen nel suo metabolita attivo che è l’Endoxifen.

ASSOCIAZIONE DI GENOTIPO CYP2D6 CON CONCENTRAZIONE PLASMATICA DI ENDOXIFEN

Ogni puntino del grafico è un pz.



  • Wt / WILD TYPE = CYP2D6 nativo [cioè non mutato ma normale, e quindi attivo]

  • Vt = CYP2D6 variante

Vediamo che la concentrazione plasmatica media di Endoxifen è:

  • più alta nella popolazione con genotipo WT.

  • è più bassa nella popolazione con una mutazione in eterozigosi

  • ed è molto bassa [quindi non presentano il metabolita attivo] nella pop portatrice dell’alterazione genetica del CYP2D6 in omozozigosi che dunque rende il CYP2D6 inattivo.




ASSOCIAZIONE DI GENOTIPO CYP2D6 CON SOPRAVVIVENZA IN PAZIENTI TRATTATE CON TAMOXIFEN

Riprendendo ciò che abbiamo detto su:


  • La curva migliore è nella popolazione WT

  • e cala nell’eterozigote

  • e la curva peggiore la abbiamo nell’omozigote.

AMPLICHIP

Ogni array contiene 10 probe complementari a DNA genomico dei geni p450.

Prima di una terapia dunque il DNA del soggetto dovrebbe essere ibridizzato con questo chip, per stabilire se quel soggetto è portatore di una alterazione genetica del CYPD6.
Il 18 ottobre 2006, questi studi sono stati presentati e discussi presso la Food and Drug Administration [FDA] , con conseguente raccomandazione unanime di cambiare l’etichetta del tamoxifen. Questo cambiamento dovrebbe includere:


  • Informazione sull’aumentato rischio di interazioni con altri farmaci metabolizzati da CYP2D6.

Se un pz prende un farmaco antidepressivo che è metabolizzato da CYPD6 in maniera concomitante al Tamoxifen, il CYPD6 se metabolizza l’antidepressivo non è disponibile a metabolizzare il Tamoxifen e dunque la terapia del Tamoxifen sarà meno efficace.

  • Menzione della possibilità di effettuare test di genotipo CYP2D6 prima d’intraprendere terapia con Tamoxifen.

ASSOCIATIONS BETWEEN COMMONLY USED ANTIDEPRESSANTS AND PLASMA ENDOXIFEN CONCENTRATION

Vediamo l’interazione del Tamoxifen con farmaci antidepressivi.

Questi pz hanno concentrazione plasmatica di Tamoxifen minori, anche se presentano un genotipo che metabolizzerebbe il Tamoxifen.

PERCHE’ USARE TEST GENETICI?

Perché vogliamo fare una medicina personalizzata nel gruppo dei pz.

Con la farmacogenomica vogliamo stabilire la tossicità di un farmaco:


  • Se è tossico  vogliamo sapere se questo tossico è benefico o no

  • oppure se non è tossico  se questo non tossico è benefico o no.

CITOFLUORIMETRIA

CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO / CFM

E’ una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule sospese in un mezzo fluido.

Rende possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cellule ad una velocità molto rapida, permettendo una dettagliata analisi qualitativa e quantitativa.


UN PO’ DI STORIA

La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni 70, determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche.

Inizialmente era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l’altro per la fluorescenza.
La CFM porto’ grande impulso allo studio del sistema immunitario: grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali [=detti MoAb] marcati con fluoresceina  chiamati FITC.

La grande complessità del sistema immunitario e la presenza di diverse subpopolazioni che reagivano con lo stesso anticorpo stimolarono:


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