Supponiamo di avere una singola sostanza sciolta in una data quantità di un determinato solvente



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14.12.2017
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Supponiamo di avere una singola sostanza sciolta in una data quantità di un determinato solvente.

  • Supponiamo di avere una singola sostanza sciolta in una data quantità di un determinato solvente.



Le concentrazioni di equilibrio rimangono costanti, pur essendo le molecole in continuo passaggio da una fase all’altra. Si tratta di un equilibrio dinamico caratterizzato dalla relazione

  • Le concentrazioni di equilibrio rimangono costanti, pur essendo le molecole in continuo passaggio da una fase all’altra. Si tratta di un equilibrio dinamico caratterizzato dalla relazione

  • Krip= [A]mob/ [A]sta



Se ora entrambe le porzioni sono affacciate a nuovi volumi di solvente differente…

  • Se ora entrambe le porzioni sono affacciate a nuovi volumi di solvente differente…



Ripetendo ora il processo di affacciamento con volumi puliti degli stessi solventi…

  • Ripetendo ora il processo di affacciamento con volumi puliti degli stessi solventi…



Ripetendo ora più e più volte il processo di affacciamento con volumi freschi di fase stazionaria e fase mobile

  • Ripetendo ora più e più volte il processo di affacciamento con volumi freschi di fase stazionaria e fase mobile



Dopo molti affiancamenti/equilibrazioni, le distribuzioni che si instaurano mostrano che la sostanza:

  • Dopo molti affiancamenti/equilibrazioni, le distribuzioni che si instaurano mostrano che la sostanza:

  • si sposta seguendo la direzione della fase mobile,

  • si accumula preferenzialmente nelle porzioni centrali

  • Le concentrazioni che si realizzano in ciascuna porzione dipendono ovviamente da quale è la “preferenza” che la sostanza mostra per le due fasi.

  • Nelle diapo successive sono indicate le distribuzioni percentuali nelle porzioni di fasi mobili dopo 5, 10, e 25 spostamenti e relative equilibrazioni per quattro diverse sostanze che presentano rapporti di distribuzione pari a

  • 1 (le due fasi sono in equilibrio quando contengono le stesse concentrazioni)

  • 2,33 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 2,33 volte quella della f.s.)

  • 4 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 4 volte quella della f.s.)

  • 9 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 9 volte quella della f.s.)













Come si vede dal grafico, questa particolare miscela non può essere risolta, cioè separata nei suoi componenti in soli 25 passaggi.

  • Come si vede dal grafico, questa particolare miscela non può essere risolta, cioè separata nei suoi componenti in soli 25 passaggi.

  • Per semplicità consideriamo una miscela formata dalle due sostanze con comportamento estremo.

  • Il grafico della diapo successiva mostra che dopo 35 spostamenti esse sono state risolte.





Si può pensare che l’operazione venga effettuata da volumi di solventi che non siano divisi fisicamente. Un flusso di fase mobile che scorra sulla fase stazionaria può essere considerata la versione continua del processo discontinuo che abbiamo appena analizzato.

  • Si può pensare che l’operazione venga effettuata da volumi di solventi che non siano divisi fisicamente. Un flusso di fase mobile che scorra sulla fase stazionaria può essere considerata la versione continua del processo discontinuo che abbiamo appena analizzato.



Al diminuire delle dimensioni delle porzioni di soluzioni studiate cresce il loro numero. Contemporaneamente, il grafico che rappresenta l’andamento della concentrazione sarà caratterizzato da barre sempre più ravvicinate.

  • Al diminuire delle dimensioni delle porzioni di soluzioni studiate cresce il loro numero. Contemporaneamente, il grafico che rappresenta l’andamento della concentrazione sarà caratterizzato da barre sempre più ravvicinate.

  • All’aumentare del numero delle porzioni in cui è stata suddivisa la soluzione, congiungendo gli estremi delle barre si otterrà una curva il cui andamento diventa sempre più prossimo a quello di una gaussiana (curva a campana), coincidendo con essa per un numero elevatissimo di equilibrazioni.



La separazione cromatografica si attua sfruttando, in modo particolarmente efficiente, la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi fra due differenti fasi.

  • La separazione cromatografica si attua sfruttando, in modo particolarmente efficiente, la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi fra due differenti fasi.

  • Le interazioni che si instaurano tra sostanza e le due fasi (mobile e stazionaria) sono spesso legami chimici secondari, sebbene in certi casi si arriva a meccanismi più complessi come lo scambio ionico.

  • I meccanismi di separazione cromatografici si basano su

  • adsorbimento,

  • ripartizione,

  • scambio ionico

  • esclusione,

  • affinità.

  • Le differenti tecniche cromatografiche vengono classificate proprio in base a quale è il meccanismo principale della separazione.





L'adsorbimento è quel fenomeno che determina il vincolarsi di una sostanza a un solido. Ciò perché sul solido ci sono i cosiddetti "centri attivi" ovvero raggruppamenti di atomi grazie ai quali esso si lega, con legami chimici secondari, ai componenti della miscela e ne ritarda il procedere.

  • L'adsorbimento è quel fenomeno che determina il vincolarsi di una sostanza a un solido. Ciò perché sul solido ci sono i cosiddetti "centri attivi" ovvero raggruppamenti di atomi grazie ai quali esso si lega, con legami chimici secondari, ai componenti della miscela e ne ritarda il procedere.



Vari sono i fattori che influenzano il fenomeno dell'adsorbimento:

  • Vari sono i fattori che influenzano il fenomeno dell'adsorbimento:

  • Struttura reticolare del solido;

  • Stato fisico del solido adsorbente: si intende praticamente la superficie di reazione che deve essere la massima possibile;

  • Struttura molecolare dell'adsorbito: la polarità di una molecola influisce sulla sua attrazione con i "centri attivi" del solido. Le molecole con gruppi polari (–OH, –NH2, ecc...) saranno più trattenute dal solido che quelle apolari;

  • Temperatura e pressione: sono fattori contrastanti a riguardo dell'adsorbimento. Mentre l'aumento di temperatura causa un aumento dell’agitazione molecolare con conseguente rottura dei legami adsorbente/adsorbito, un aumento della pressione favorisce l'addensarsi di un componente gassoso sul solido.

  • L'adsorbimento quindi si basa sulla selettività del trattenimento dell'adsorbente nei confronti di adsorbiti diversi in base alle caratteristiche del solido adsorbente e alle condizioni interne (T e P) alla colonna.



Le interazioni che intercorrono tra le differenti sostanze e il solido con i suoi centri attivi sono paragonabili a ciò che succede quando due diverse palline scorrono su una tavola irta di chiodi. La diversa superficie delle palline, così come la diversa polarità delle molecole, assicurerà un maggior o minore trattenimento da parte delle punte dei chiodi, paragonabili ai centri attivi del solido.

  • Le interazioni che intercorrono tra le differenti sostanze e il solido con i suoi centri attivi sono paragonabili a ciò che succede quando due diverse palline scorrono su una tavola irta di chiodi. La diversa superficie delle palline, così come la diversa polarità delle molecole, assicurerà un maggior o minore trattenimento da parte delle punte dei chiodi, paragonabili ai centri attivi del solido.



Quando la fase stazionaria è un liquido, si verifica una vera e propria solubilizzazione in essa dei componenti della miscela. Quando anche la fase mobile è liquida, i processi cromatografici sono governati dalla legge di ripartizione di Nernst.

  • Quando la fase stazionaria è un liquido, si verifica una vera e propria solubilizzazione in essa dei componenti della miscela. Quando anche la fase mobile è liquida, i processi cromatografici sono governati dalla legge di ripartizione di Nernst.

  • Esse pertanto si ripartiscono fra le due fasi (immiscibili fra loro) in condizioni di equilibrio secondo un rapporto costante che dipende dalla solubilità del campione nei due solventi:

  • K = CX / CY



Si utilizza una resina con funzioni cariche bilanciate da ioni di segno opposto (1), per esempio -COO- H+.

  • Si utilizza una resina con funzioni cariche bilanciate da ioni di segno opposto (1), per esempio -COO- H+.

  • Queste funzioni sono in grado di scambiare i propri controioni (H+ nell’esempio citato) con altri di segno uguale (Na+, Ca2+, K+, etc ) provenienti dalla soluzione (2).

  • Facendo passare il controione originale della resina (H+ nel caso illustrato) in elevata concentrazione, gli ioni provenienti dalla soluzione sono restituiti in modo differenziato, in funzione di carica e dimensioni, e quindi eluiti separatamente.



La fase stazionaria è un gel con pori di varie dimensioni. I componenti della miscela vengono separati in funzione delle loro dimensioni: quelli più piccoli possono penetrare in tutti i pori dei granuli e quindi sono trattenuti a lungo, mentre quelli più grandi possono solo “girare attorno” ai granuli di gel e quindi usciranno velocemente.

  • La fase stazionaria è un gel con pori di varie dimensioni. I componenti della miscela vengono separati in funzione delle loro dimensioni: quelli più piccoli possono penetrare in tutti i pori dei granuli e quindi sono trattenuti a lungo, mentre quelli più grandi possono solo “girare attorno” ai granuli di gel e quindi usciranno velocemente.



La tecnica è usata soprattutto per separare molecole organiche ad alto peso molecolare come proteine, acidi nucleici, carboidrati. Trova applicazione in campo biologico quando detti composti sono presenti in matrici complesse facilmente degradabili per altre vie.

  • La tecnica è usata soprattutto per separare molecole organiche ad alto peso molecolare come proteine, acidi nucleici, carboidrati. Trova applicazione in campo biologico quando detti composti sono presenti in matrici complesse facilmente degradabili per altre vie.



Il comportamento è molto simile a quello dell’adsorbimento in quanto i componenti della miscela si legano a “siti attivi” della fase stazionaria (a e b). A differenza dell’adsorbimento, si hanno legami veri e propri (primari).

  • Il comportamento è molto simile a quello dell’adsorbimento in quanto i componenti della miscela si legano a “siti attivi” della fase stazionaria (a e b). A differenza dell’adsorbimento, si hanno legami veri e propri (primari).

  • Le reazioni che li hanno formati sono comunque reversibili e facendo eluire un solvente opportuno è possibile restituire in modo differenziato i componenti che erano stati trattenuti (C).





Per esempio, si può isolare l'RNA messaggero che si differenzia dagli altri RNA (RNA transfert e ribosomiale), per la presenza di una coda di poly A. Da un estrazione di RNA totale della cellula (lisi, centrifugazione, DNAsi), si esegue una cromatografia per affinità usando una resina particolare in cui siano presenti dei poly T. In questo modo posso estrarre e purificare i miei RNA messaggeri.

  • Per esempio, si può isolare l'RNA messaggero che si differenzia dagli altri RNA (RNA transfert e ribosomiale), per la presenza di una coda di poly A. Da un estrazione di RNA totale della cellula (lisi, centrifugazione, DNAsi), si esegue una cromatografia per affinità usando una resina particolare in cui siano presenti dei poly T. In questo modo posso estrarre e purificare i miei RNA messaggeri.



A seconda di quale sia il meccanismo prevalente e di come si presentino la fase stazionaria e quella mobile si possono avere più tecniche cromatografiche che vanno da un semplice foglio di carta porosa che pesca in una bacinella contenente il solvente, a strumenti assistiti da componenti computerizzati.

  • A seconda di quale sia il meccanismo prevalente e di come si presentino la fase stazionaria e quella mobile si possono avere più tecniche cromatografiche che vanno da un semplice foglio di carta porosa che pesca in una bacinella contenente il solvente, a strumenti assistiti da componenti computerizzati.





Abbiamo visto che unendo i punti delle barre che rappresentano le concentrazioni nelle porzioni consecutive della fase mobile si ottiene una gaussiana.

  • Abbiamo visto che unendo i punti delle barre che rappresentano le concentrazioni nelle porzioni consecutive della fase mobile si ottiene una gaussiana.

  • Poiché nella maggior parte dei sistemi cromatografici destinati a misure quantitative vi è un sistema di misura che rileva la concentrazione della sostanza, esso restituirà tale informazione proprio sotto forma di tale curva.



I segnali si presentano spesso asimmetrici o parzialmente sovrapposti ma tali picchi hanno dei parametri caratteristici che derivano appunto dalla loro natura gaussiana.

  • I segnali si presentano spesso asimmetrici o parzialmente sovrapposti ma tali picchi hanno dei parametri caratteristici che derivano appunto dalla loro natura gaussiana.



Altezza del picco h

  • Altezza del picco h

  • Ampiezza a metà altezza wh1/2

  • Larghezza della base wb

  • Distanza tra i punti di flesso wi

  • tra loro esistono le relazioni

  • wi = wb/2 = 2 

  • wb = 1,699 wh1/2

  • wh = 1,177 wi



Altri parametri importanti sono

  • Altri parametri importanti sono

  • tR tempo di ritenzione

  • tR’ tempo di ritenzione corretto

  • tM tempo morto

  • per evidenziare la relazione tra il tempo che una sostanza impiega per passare e impiega per mettersi in equilibrio con la fase stazionaria

  • tR’ =tR - tM e il volume di ritenzione corretto VR’= tR’FC

  • Area del picco



Come per la ripartizione, così anche per qualsiasi altro meccanismo si può definire una costante che rappresenti il rapporto tra le concentrazioni di una sostanza nella fase stazionaria (Cs ) e nella fase mobile (CM). La chiameremo costante di distribuzione e dipenderà, oltre che dalla temperatura, dalla coppia di fasi usate:

  • Come per la ripartizione, così anche per qualsiasi altro meccanismo si può definire una costante che rappresenti il rapporto tra le concentrazioni di una sostanza nella fase stazionaria (Cs ) e nella fase mobile (CM). La chiameremo costante di distribuzione e dipenderà, oltre che dalla temperatura, dalla coppia di fasi usate:

  • Kd= Cs /CM



Vista come è costruita, tanto maggiore è la Kd di una sostanza relativa a una coppia di fasi e

  • Vista come è costruita, tanto maggiore è la Kd di una sostanza relativa a una coppia di fasi e

    • tanto più sarà trattenuta dalla fase stazionaria
    • tanto più sarà elevato il suo tempo di ritenzione


Per una data sostanza si ha tR= tempo di ritenzione, cioè il tempo che una sostanza deve usare per scorrere attraverso una colonna facendo le interazioni tM= tempo morto, cioè il tempo che una sostanza che non faccia alcuna interazione utilizza comunque per passare t’R= tempo di ritenzione corretto = tR - tM

  • Per una data sostanza si ha tR= tempo di ritenzione, cioè il tempo che una sostanza deve usare per scorrere attraverso una colonna facendo le interazioni tM= tempo morto, cioè il tempo che una sostanza che non faccia alcuna interazione utilizza comunque per passare t’R= tempo di ritenzione corretto = tR - tM

  • Tenendo conto del flusso (F) della fase mobile, si possono considerarne anche i volumi usati. Analogamente si avrà il volume di ritenzione VR= F tR il volume morto VM= F tM



La relazione tra la costante e i parametri del picco è espressa dall’equazione fondamentale della cromatografia

  • La relazione tra la costante e i parametri del picco è espressa dall’equazione fondamentale della cromatografia

  • VR= VM+ KdVS dove

  • VR= volume di ritenzione di una data sostanza

  • VM= volume morto (o volume della fase mobile)

  • VS = volume della fase stazionaria



Si preferisce allora, invece di Kd, far riferimento al fattore di ritenzione, espresso come le moli distribuite tra le due fasi

  • Si preferisce allora, invece di Kd, far riferimento al fattore di ritenzione, espresso come le moli distribuite tra le due fasi

  • k = ns/nM

  • Si può dimostrare che questo parametro è determinabile da valori del cromatogramma secondo la relazione

  • k = t’R / tM

  • Anch’esso dipende dalla temperatura e dalla coppia delle fasi in uso ma anche dalle caratteristiche dell’impaccamento, dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria.

  • Buone separazioni si hanno se la prima sostanza eluita ha k superiore a 1. Quelle successive devono comunque avere k non superiori a 10-15 onde evitare tempi lunghi per le analisi ed eccessiva dispersione (i picchi si appiattiscono troppo)



La selettività indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse con velocità tali che escano separate dalla colonna.

  • La selettività indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse con velocità tali che escano separate dalla colonna.



La qualità di una separazione cromatografica non dipende solo da ma anche dalla capacità di un sistema di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità

  • La qualità di una separazione cromatografica non dipende solo da ma anche dalla capacità di un sistema di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità

  • La capacità di formare picchi molto stretti è l’ efficienza



Il numero dei piatti teorici di una colonna cromatografica è ricavabile da

  • Il numero dei piatti teorici di una colonna cromatografica è ricavabile da

  • N = 16 (tR/wb)2

  • mentre facendo riferimento al tempo di ritenzione corretto, si definisce il numero dei piatti effettivi

  • Neff = 16 (t’R/wb)2

  • E’ importante precisare che N non è un parametro caratteristico per una data colonna, poiché dipende anche dalla sostanza eluita. Ciò significa che una stessa colonna attraversata da due sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.

  • Il concetto di piatto teorico è stato preso a prestito dalla teoria della colonna di distillazione. Si può immaginare che una colonna cromatografica, come una di distillazione, sia suddivisa appunto in tante zone in cui si instaura l’equilibrio di ripartizione dell’analita tra fase stazionaria e fase mobile (vedi CROMATOGRAFIA 1).



La sostanza si sposta verso la fine della colonna attraverso la fase mobile che, in equilibrio su un piatto, si passa al piatto successivo.

  • La sostanza si sposta verso la fine della colonna attraverso la fase mobile che, in equilibrio su un piatto, si passa al piatto successivo.

  • È importante sottolineare che, a differenza della colonna di distillazione, i piatti non esistono realmente all’interno della colonna ma sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene.

  • Se si aumenta N, diminuisce il numero dei piatti teorici su cui si distribuisce ogni sostanza poiché aumentano gli equilibri a cui essa è sottoposta; a parità di lunghezza, pertanto, si accorcia il tratto di colonna su cui si distribuisce ogni sostanza.





L’efficienza di una colonna aumenta con il numero dei piatti: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul cromatogramma.

  • L’efficienza di una colonna aumenta con il numero dei piatti: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul cromatogramma.



Una colonna è tanto più efficiente (nei confronti di una determinata specie chimica), e fornisce quindi picchi tanto più stretti, quanto minore è il valore di H.

  • Una colonna è tanto più efficiente (nei confronti di una determinata specie chimica), e fornisce quindi picchi tanto più stretti, quanto minore è il valore di H.

  • Il parametro H è indipendente dalla lunghezza della colonna e quindi è più adatto di N per confrontare le prestazioni di colonne diverse verso una stessa sostanza.

  • Il numero di piatti teorici, e quindi la loro altezza, può essere calcolato esaminando un picco cromatografico dopo l’eluizione.

  • Neff = 16 (t’R/wb)2













FASE MOBILE

  • FASE MOBILE

  • La polarità è fondamentale per la scelta dell’eluente è da essa che dipende l’entità del trascinamento delle sostanze lungo la lastrina in una TLC

  • potere eluente: capacità relativa dei vari solventi di far muovere una sostanza su una fase stazionaria

  • serie eluotropa: Il potere eluente dei più comuni solventi organici, puri ed in miscele, ordinato secondo polarità crescente



























I valori di Rf possono essere usati per identificare una sostanza per confronto con degli standard;

  • I valori di Rf possono essere usati per identificare una sostanza per confronto con degli standard;

  • Il valore di Rf non è una costante fisica ed il confronto DEVE ESSERE FATTO SOLO tra macchie presenti sulla stessa lastrina e sviluppate nello stesso modo e contemporaneamente;

  • - Due sostanze che hanno lo stesso valore di Rf, nelle medesime condizioni cromatografiche, potrebbero essere identiche; invece quelle che hanno diversi valori di Rf sicuramente non lo sono!





















Analizzare un concentrato di pomodoro

  • Analizzare un concentrato di pomodoro

  • Estrarre sostanze principali: licopene e β-carotene

  • Eseguire la tecnica cromatografica TLC

  • Separare ed identificare componenti



LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero, uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per curare le malattie degenerative delle cellule.

  • LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero, uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per curare le malattie degenerative delle cellule.



β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti naturali, ad esempio della carota.

  • β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti naturali, ad esempio della carota.



Materiale utilizzato:

  • Materiale utilizzato:

  • Bilancia tecnica

  • Pipette graduate

  • 2 becker, beuta, matraccio

  • Cotone idrofilo

  • Sostanze utilizzate:

  • 50g pomodoro concentrato

  • Diclorometano

  • N-esano

  • Alcool etilico 95%

  • Sodio solfato anidro



Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la spatola;

  • Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la spatola;

  • Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la miscela pressando leggermente

  • Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;

  • Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;

  • Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il filtrato in una beuta.

  • Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.





Il β-carotene è la componente che sale con maggiore velocità sulla lastra a causa della maggiore affinità con l’eluente.

  • Il β-carotene è la componente che sale con maggiore velocità sulla lastra a causa della maggiore affinità con l’eluente.

  • Il licopene invece viene rallentato perché instaura dei legami con la fase stazionaria che è il gel di silice.



L’analisi dei dati si basa su un fattore chiamato: Rf

  • L’analisi dei dati si basa su un fattore chiamato: Rf

  • Rf= corsa della macchia /corsa

  • dell’eluente

  • Ogni sostanza ha un Rf diverso.





LICOPENE STANDARD

  • LICOPENE STANDARD



β – CAROTENE STANDARD

  • β – CAROTENE STANDARD



La tecnica TLC permette di separare i componenti principali di una miscela;

  • La tecnica TLC permette di separare i componenti principali di una miscela;

  • le sostanze estratte sono pure, cioè molto simili agli standard.

  • E’ possibile estrarre i componenti dal pomodoro.





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