Viii. Frazionamento del carbonio organico



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VIII. Frazionamento del carbonio organico
di Luisella Celi e Claudio Ciavatta
La sostanza organica del suolo (SOM) è caratterizzata da un continuum di composti a diverso grado di decomposizione, che variano da molecole molto semplici e solubili in acqua fino a strutture macromolecolari e/o supramolecolari (Piccolo, 2002). Processi quali la decomposizione microbica con la preservazione selettiva della componente più recalcitrante, l’occlusione in aggregati inaccessibili agli organismi decompositori e l’interazione con la fase minerale, influenzano la distribuzione della sostanza organica in differenti pools caratterizzati, ciascuno, da un diverso turnover e da una diversa funzionalità (von Lützow et al., 2006; Schmidt et al., 2011). Infatti, le numerose proprietà, quali gli effetti diretti ed indiretti sulla fertilità e sull’organizzazione strutturale, il ruolo come sink di CO2 per contrastare il cambiamento climatico, la sua elevata capacità ad interagire e ad influenzare il destino degli xenobiotici (Lal, 2007), non dipendono solo dal contenuto di sostanza organica, ma anche dalla sua distribuzione e dalle complesse dinamiche nel sistema suolo.

Nel tempo sono stati messi a punto numerosi metodi di frazionamento sia chimico sia fisico con lo scopo di separare, quantificare e caratterizzare le diverse frazioni organiche in relazione allo loro specifica funzione (von Lützow et al., 2007). Pertanto, diventa fondamentale individuare il metodo più appropriato in relazione al tipo di informazione richiesta.

Tra i metodi chimici, il più classico prevede l’estrazione della SOM utilizzando una soluzione alcalina di idrossido di sodio (NaOH) e di pirofosfato di sodio (Na4P2O7). Tale estraente è in grado sia di provocare la dissociazione dei gruppi funzionali acidi della SOM e la dispersione mediante l’azione deflocculante del sodio, sia di idrolizzare legami SOM-frazione minerale e/o SOM-metalli. La sostanza organica viene così separata in una frazione contenente il carbonio estraibile (TEC) e in una ancora intimamente legata alla fase minerale, l’umina (HU). La soluzione contenente il TEC viene successivamente trattata con una soluzione acida in modo da determinare la precipitazione della frazione meno polare, gli acidi umici (HA), mentre la frazione che rimane in soluzione costituisce gli acidi fulvici (FA).

FA, HA e umina variano in base al peso molecolare crescente e polarità decrescente (Stevenson, 1994). Tali frazioni sono quantitativamente e qualitativamente influenzate dal tipo di suolo e dai processi pedogenetici, nonché dall’uso e dalla gestione del suolo stesso. Il frazionamento chimico è in grado, inoltre, di isolare dalla fase minerale quantità relativamente elevate di materiale organico permettendo quindi l’applicazione di tecniche chimiche e spettroscopiche per la successiva caratterizzazione. Tuttavia, poiché l’estraente determina l’idrolisi di legami sia tra molecole organiche sia con la fase minerale, questo metodo separa contemporaneamente frazioni stabilizzate da diversi meccanismi portando quindi a pools non omogenei dal punto di vista del loro turnover.

In alternativa si possono considerare le tecniche di frazionamento fisico, sviluppate allo scopo di relazionare meglio struttura del suolo e funzione dei pools organici. La SOM viene separata sfruttando tecniche di dispersione e di separazione dimensionale o densitometrica. La separazione dimensionale si basa sull’assunzione che frazioni organiche con caratteristiche, struttura e funzioni specifiche siano diversamente distribuite nei diversi aggregati e/o associate a minerali di diversa dimensione (Six et al., 2001). Il frazionamento densitometrico, basandosi sulla diversa densità tra la sostanza organica e la fase minerale, permette di separare una frazione organica che rimane libera e non protetta da frazioni che interagiscono fisicamente e/o chimicamente con la fase minerale. La frazione organica libera è definita da Christensen (2001) come un pool di transizione tra i residui vegetali freschi e la SOM associata alla fase minerale, in quanto non protetta dalla fase minerale e facilmente degradabile per la presenza di legami idrolitici e monomeri; la SOM legata alla fase minerale più fine rappresenta invece l’unità più stabile perché protetta chimicamente e fisicamente dall’attacco microbico (Cerli et al., 2012). Con questa tecnica di frazionamento è quindi possibile separare la SOM in differenti pools in base al loro turnover e quindi al loro tempo di residenza nel suolo (Golchin et al., 1994).

A differenza dell’estrazione chimica, le tecniche di frazionamento fisico permettono di separare frazioni organiche pressoché inalterate e di tener conto del loro arrangiamento spaziale e della loro interazione con la fase minerale. Tuttavia, anche in questo caso vi sono delle limitazioni legate ad una mancanza di standardizzazione dei metodi e ad un’eterogeneità di ciascun pool dal punto di vista chimico, per cui questi metodi sono spesso proponibili come un pre-estrazione cui far seguire l’estrazione chimica.





Frazionamento chimico in acidi fulvici, umici e umina


Principio


La tecnica si basa sulla diversa solubilità delle frazioni organiche a seconda del pH del mezzo. Allo scopo viene utilizzato come estraente una soluzione di NaOH, da sola o con Na4P2O7. L’estraente basico provoca la dissociazione dei gruppi funzionali acidi della sostanza organica e l’idrolisi di legami SO-minerale e/o SO-Men+. Il Na4P2O7 favorisce la dispersione degli aggregati grazie all’azione deflocculante del sodio. Inoltre la sostituzione degli ioni polivalenti con il catione sodio (Na+) è favorita anche dalla capacità chelante del pirofosfato. La sostanza organica viene così separata in una frazione contenente il carbonio totale estraibile (TEC) e in una intimamente legata alla fase minerale, l’umina (HU). La soluzione contenente il TEC viene successivamente trattata con una soluzione acida in modo da determinare la precipitazione della frazione meno polare, gli acidi umici (HA), mentre la frazione che rimane in soluzione costituisce la frazione più polare con un rapporto carica/massa maggiore, chiamata dal tipico colore rosso-arancio, acidi fulvici (FA). Insieme agli acidi umici e fulvici, però, vengono solubilizzate ed estratte anche componenti meno degradate della SOM, quali oligo- e polisaccaridi solubili, amminoacidi e residui peptidici, che possono rimanere in soluzione dopo acidificazione e quindi interferire con la determinazione degli FA. Risulta fondamentale, pertanto, la purificazione delle sostanze umiche dopo l’estrazione, in modo da separare la componente non umica (NH) dagli FA, mediante cromatografia di adsorbimento in fase solida su resina di polivinilpirrolidone. Tale resina ha la capacità di trattenere mediante legami a idrogeno la componente fenolica degli acidi fulvici lasciando invece eluire la frazione non umica che viene quindi allontanata. Successivamente gli acidi fulvici adsorbiti vengono eluiti con una soluzione di NaOH che provoca la rottura dei legami ad H per ionizzazione dei gruppi fenolici.

Per la determinazione del carbonio organico nell’estratto e nelle sue frazioni si raccomanda la determinazione attraverso metodo ossidimetrico con bicromato in ambiente acido (Ciavatta et al., 1991).


Reagenti

Soluzione di sodio pirofosfato e sodio idrossido 0,1 M: Sciogliere in un matraccio tarato da 1 L 44,61 g di sodio pirofosfato (Na4P2O7·10 H2O) e 4,00 g di sodio idrossido (NaOH). Dopo la solubilizzazione dei reagenti, portare a volume con acqua deionizzata.

Azoto gassoso tecnico (N2)

Acido solforico 9 M: aggiungere con cautela in matraccio tarato da 1 L contenente circa 400 mL di H2O deionizzata, 520 mL di acido solforico concentrato (H2SO4) [96%, ρ = 1,835]. Mescolare e, dopo raffreddamento, portare a volume con H2O deionizzata.

Acido solforico 0,005 M: aggiungere con cautela in matraccio tarato da 1 L contenente circa 400 mL di H2O deionizzata, 3,0 mL di acido solforico concentrato (H2SO4) [96%, ρ = 1,835]. Mescolare e, dopo raffreddamento, portare a volume con H2O deionizzata.

Polivinilpirrolidone (PVP) resina insolubile: Trasferire in un contenitore trasparente da 2 L 50 g di PVP e lavare con acqua di rubinetto. Lasciare decantare per circa 15 minuti e scartare le frazioni ancora in sospensione. Ripetere l’operazione, in successione, due volte con H2O di rubinetto e due volte con H2O deionizzata. Aggiungere una quantità di H2SO4 0,005M sufficiente a coprire completamente la resina. Agitare e controllare che il valore di pH della sospensione sia nell’intervallo 1-2. La resina così preparata può essere conservata a temperatura ambiente, in recipiente chiuso, e coperta di soluzione.

Sodio idrossido 0,5 M: sciogliere in matraccio tarato da 1 L, contenente circa 400 mL di H2O, 20 g di sodio idrossido (NaOH). Mescolare e, dopo raffreddamento portare a volume con acqua deionizzata.

Bicromato di potassio 0,33 M: sciogliere 98,06 gr di K2Cr2O7 preventivamente essiccato in stufa in 1 litro di acqua deionizzata.

Solfato di ferro (II) 0,2 M: Trasferire in matraccio tarato da 1 L, contenente circa 100 mL di H2O 55,6 g di FeSO4·7H2O. Aggiungere lentamente facendoli scorrere lungo le pareti interne del matraccio 20 mL di H2SO4 concentrato. Mescolare e, dopo raffreddamento, portare a volume con acqua deionizzata. La soluzione non è stabile e quindi va ripreparata frequentemente (ogni 2 giorni). In ogni caso, il titolo della soluzione deve essere controllato per ogni serie di analisi.

Acido fosforico (H3PO4) [85%, ρ = 1,695]

Indicatore redox: Sciogliere in 50 mL di H2SO4 concentrato [96%, ρ=1.835] in matraccio tarato da 100 mL, 0,2 g di sodio 4-difenilamminosolfonato (C12H10NaNO3S]. Portare a volume con H2SO4 concentrato.

Argento solfato (Ag2SO4) cristalli

Lana di vetro
Apparecchiatura

Agitatore con bagno termostatico regolabile a 65°C

Centrifuga corredata di rotore e adattatori per tubi da 50 mL e 150 mL

Sistema per filtrazione con filtri a membrana, corredato di filtri GF/D

Siringhe in plastica da 10 mL

Palloni per l’attacco da 200 mL forniti di canna a ricadere e mantello riscaldante

Potenziometro o pH-metro con possibilità di lettura del potenziale. In alternativa titolatore automatico corredato di elettrodo combinato di platino e buretta automatica da 5 mL.

Agitatore magnetico



Estrazione del carbonio organico (TEC)

Trasferire in un contenitore a chiusura ermetica da 250 mL 10 g di suolo secco all’aria e setacciato a 0,5 mm. Aggiungere 100 mL (Vtot estratto) della soluzione di sodio pirofosfato 0,1 M e sodio idrossido 0,1 M e far gorgogliare N2 per circa 1 minuto. Tappare ermeticamente il recipiente e agitare il campione al buio per 24 ore in un bagno Dubnoff regolato a 80 scosse al minuto ed a 65°C. Successivamente, raffreddare e centrifugare a 3000 giri per 20 minuti. Filtrare il surnatante sottovuoto con filtri GF/D. Travasare il filtrato in contenitore asciutto. Far gorgogliare N2 ancora per un minuto e tappare ermeticamente.




  1. Frazionamento degli acidi umici e degli acidi fulvici


La tecnica di frazionamento è basata sulla diversa solubilità degli acidi fulvici ed umici a seconda del pH della soluzione: gli acidi fulvici sono solubili a qualunque valore di pH, mentre gli acidi umici lo sono solo in ambiente basico.
Preparare le colonnine cromatografiche di polivinilpirrolidone (PVP), utilizzando siringhe ipodermiche di plastica da 10 mL in cui viene sostituito l’ago con un tubicino di plastica chiuso con una pinza. Introdurre nella siringa lana di vetro e pressarla sul fondo fino a formare uno strato di circa 0,5 cm di spessore. Versare nella siringa, fissata in posizione verticale ad un apposito supporto, una quantità di resina acidificata sufficiente a formare una colonna di 4-6 cm3. Aprire la pinzetta per far defluire il liquido, avendo cura di non far andare a secco la colonna.

Prelevare 25 mL dell’estratto (TEC) (V prelevato dall’estratto TEC) e porli in un tubo da centrifuga. Portare il pH ad un valore inferiore a 2 con H2SO4 9 M. Chiudere ermeticamente, agitare e lasciare riposare una notte affinché gli acidi umici precipitino. Centrifugare per 20 minuti a 3000 rpm fino ad ottenere una sedimentazione soddisfacente.

Trasferire quindi il surnatante con cautela, utilizzando una pipetta Pasteur, nella colonnina cromatografica di PVP. Lasciare defluire la soluzione, avendo cura che la resina non vada a secco. Raccogliere e scartare l’eluato contenente la frazione non umica (NH). Al termine lavare la colonnina con 25 mL di H2SO4 0,005M, lasciando defluire la soluzione acida fino ad un livello posto appena al di sopra dello strato di resina.

Eluire quindi la frazione adsorbita sul PVP con la soluzione di sodio idrossido 0,5 M. Scartare tutto l’eluato fino a che dalla siringa non esce la prima goccia colorata in giallo o giallo-bruno. Porre un beaker da 25 mL al di sotto della siringa e raccogliere la soluzione colorata. Continuare l’eluizione con la soluzione di NaOH 0,5 M sino a che il liquido in uscita non appare completamente incolore. Trasferire quantitativamente la frazione fulvica in un matraccio da 50 mL (VFA) e portare a volume con la soluzione eluente di NaOH. La soluzione è quindi pronta per la determinazione quantitativa degli FA.


Al residuo che rimane dopo centrifugazione aggiungere circa 20 mL di soluzione di NaOH 0,5 M per riportare in soluzione gli HA e travasare in un matraccio da 50 mL (VHA) portando a volume con NaOH 0,5 M, ottenendo quindi la soluzione per la determinazione quantitativa degli HA.
Determinazione del carbonio organico nelle soluzioni contenenti TEC, FA e HA (Springer e Klee, 1954)

Prelevare un’aliquota nota (non superiore a 10 mL e con un contenuto in C organico compreso tra 5 e 25 mg) (Vprel da HA o FA) e porla in un pallone per l’attacco acido, munito di sistema refrigerante.

Prelevare con buretta di precisione e trasferire nel pallone 20 mL della soluzione di K2Cr2O7, aggiungere con cautela 26 mL di H2SO4 concentrato [96%, ρ = 1,835] goccia a goccia con una buretta, ponendo il pallone a bagno in un beaker da 1 o 2 L pieno d’acqua e qualche cristallo di solfato d’argento per eliminare eventuali residui di cloro che potrebbero interferire con l’ossidazione.

Inserire la canna a ricadere nel pallone e agitare. Dopo aver sistemato il pallone su mantello riscaldante riscaldare il più rapidamente possibile per raggiungere la temperatura di 160 ± 2°C. Mantenere costante la temperatura per 10 minuti esatti, agitando leggermente la miscela. Raffreddare rapidamente a temperatura ambiente e trasferire quantitativamente il contenuto in un matraccio tarato da 200 mL (Vox). Portare a volume con acqua. Mescolare e lasciare sedimentare l’eventuale residuo minerale.


Titolazione volumetrica

Prelevare con pipetta di precisione e trasferire in beuta di Erlenmeyer da 250 mL a collo largo 20 mL della soluzione limpida (Vtit). Aggiungere 100 mL di H2O e, in successione, 8 mL di H3PO4 e 0,5 mL dell’indicatore.

Sistemare la beuta sull’agitatore magnetico e titolare con la soluzione di FeSO4 da violetto scuro a verde.
Titolazione potenziometrica

Nel caso della titolazione potenziometrica il potenziale varia da circa 900-1000 mV a 650-700 mV oltre il punto di equivalenza. Se viene utilizzato il titolatore automatico, è opportuno operare aggiunte unitarie non superiori ai 3 L.


Determinazione del titolo effettivo della soluzione di FeSO4

La soluzione di FeSO4 non è stabile a causa dell’ossidazione dello ione ferroso da parte dell’ossigeno. La reazione di ossidazione si verifica, seppur lentamente, anche sul sale allo stato solido. E’ necessario pertanto, attraverso un’ossidazione a freddo, determinare il titolo esatto della soluzione di FeSO4 per ogni serie di analisi. Tale bianco verrà definito Bianco Freddo.


Trasferire in un pallone da 200 mL, sistemato in un bagno di H2O e ghiaccio, 5 mL della soluzione di NaOH e Na4P2O7 0,1 M. Prelevare con buretta di precisione e trasferire nel pallone 20 mL della soluzione di K2Cr2O7. Aggiungere con cautela 26 mL di H2SO4 concentrato goccia a goccia con una buretta. Raffreddare rapidamente a temperatura ambiente e trasferire quantitativamente il contenuto in un matraccio tarato da 200 mL. Portare a volume con acqua.

Prelevare con pipetta di precisione e trasferire in beuta di Erlenmeyer da 250 mL a collo largo 20 mL della soluzione limpida. Aggiungere 100 mL di H2O e, in successione, 8 mL di H3PO4 concentrato e 0,5 mL dell’indicatore.

Sistemare la beuta sull’agitatore magnetico e titolare con la soluzione di FeSO4 da violetto scuro a verde.

Tenuto conto che


MFeSO4 · VFeSO4 = MK2Cr2O7 · V K2Cr2O7 · 6

dove:


MFeSO4 = molarità effettiva della soluzione di ferro (II) solfato

VFeSO4 = volume (mL) della soluzione di FeSO4 impiegato per la titolazione di V K2Cr2O7

VK2Cr2O7 = volume della soluzione di K2Cr2O7 utilizzata per la titolazione (2 mL)· V K2Cr2O7

MK2Cr2O7 = molarità della soluzione (0,33 M) di K2Cr2O7

6 = elettroni in gioco nella reazione di ossidoriduzione

Si ottiene quindi:

MFeSO4 = (MK2Cr2O7 · V K2Cr2O7) / VFeSO4 = 4/VFeSO4
Determinazione del titolo effettivo della soluzione di K2Cr2O7

Il metodo prevede inoltre di trattare una quantità nota della soluzione di K2Cr2O7 allo stesso modo per effettuare contemporaneamente la correzione relativa alla possibile parziale decomposizione del bicromato a caldo ed il controllo che tale decomposizione non sia stata eccessiva (Bianco Caldo).


Effettuare nelle stesse condizioni sperimentali una prova in bianco a caldo (160 ± 2 °C) per accertare l’errore eventualmente causato dalla parziale decomposizione del bicromato in seguito al riscaldamento. Una differenza maggiore di 0,4 mL tra la titolazione della soluzione di bicromato a temperatura ambiente e quella a caldo indica la presenza di un errore o nella determinazione della molarità del FeSO4 o nella procedura di riscaldamento.
Calcolo

Carbonio organico (g kg-1 di suolo) = 3/2(VBC – Vcampione) · MFeSO4 /6 · Vox /Vtit · 12 · R·1/m

dove:

3/2 0 rapporto molare della reazione di ossidoriduzione



VBC = volume (mL) di FeSO4 impiegati per la titolazione del Bianco Caldo

Vtit = volume (mL) di FeSO4 impiegati per la titolazione del campione

VBC = volume (mL) di FeSO4 impiegati per la titolazione del Bianco Caldo

MFeSO4 = normalità di FeSO4 ricavata attraverso la titolazione del Bianco Freddo

R =rapporto volumetrico che varia a seconda della soluzione da analizzare*

12 = peso atomico del carbonio

m = massa del campione di terra fine espressa in grammi
* TEC = 3/2(VBC – Vcampione) · MFeSO4 /6 · Vox /Vtit · Vestratto/Vprel da HA o FA 12 · 1/m

* HA = 3/2(VBC – Vcampione) · MFeSO4 /6 · Vox /Vtit · Vestratto/ Vprel da HA o FA · Vtot estratto/V prelevato dall’estratto TEC ·12 · 1/m

* FA = 3/2(VBC – Vcampione) · MFeSO4 /6 · Vox /Vtit · Vestratto/ Vprel da HA o FA · Vtot estratto/V prelevato dall’estratto TEC ·12 · 1/m

Frazionamento densitometrico della sostanza organica del suolo

Il frazionamento densitometrico si basa sulla differente densità tra la sostanza organica (d = 1,4 g cm-3) e la fase minerale (2,65 g cm-3) ed è spesso affiancato da dispersione fisica e/o chimica (Golchin et al., 1994). Utilizzando un liquido di appropriata densità è possibile separare la frazione organica particolata (POM) che rimane libera (fPOM) e quindi galleggia dalle frazioni che interagiscono fisicamente e/o chimicamente con la fase minerale. La frazione organica libera rappresenta il materiale meno protetto e quindi più suscettibile di attacco microbico mentre la SOM legata alla fase minerale rappresenta invece l’unità più stabile perché protetta chimicamente e fisicamente dall’attacco microbico. Su quest’ultima frazione, determinando la dispersione degli aggregati, è possibile separare ulteriormente una frazione occlusa fisicamente all’interno degli aggregati (oPOM) e una chimicamente legata alla fase minerale (MOM) e che rimarrà legata alla fase inorganica. Con questa tecnica di frazionamento è quindi possibile separare la SOM in differenti pools sulla base della loro distribuzione spaziale e del grado di stabilizzazione offerto dall’interazione con la fase minerale. Il metodo presenta due parametri cruciali, quali la scelta della densità del liquido e l’intensità di dispersione da applicare per la separazione dell’oPOM dalla MOM (Cerli et al., 2012). Per definire l’energia da applicare si consiglia di condurre un pre-esperimento sul suolo in modo tale da individuare l’energia necessaria per disperdere la oPOM, ma limitare la dispersione delle argille.


Reagenti

Soluzione di sodio politungstato (NaPT) 1,.6 kg dm-3: in un beaker da 2L pre-pesato aggiungere 741 g di NaPT e 859 mL di H2O deionizzata al fine di ottenere una soluzione del volume di 1 L. Agitare su agitatore magnetico fino a solubilizzare completamente il sale. Pesare il beaker con la soluzione e verificare che la soluzione sia 1,6 kg ed eventualmente aggiungere acqua o NaPT per raggiungere la densità appropriata.

Filtri in microfibra di vetro GF/F (Ø 55 mm)
Apparecchiatura

Generatore di ultrasuoni con sonotrodo cilindrico (ø 13 mm)

Centrifuga e tubi da centrifuga da 500 mL

Stufa ventilata

Pompa per il vuoto

Bilancia tecnica ed analitica

Conducimetro

Termometro

Liofilizzatore

Essiccatore

Analizzatore CN

Agitatore magnetico



Per ciascun campione:

Imbuti bückner in plastica

Beute per filtrazione a vuoto da 250 mL

Spatola di gomma e bacchetta di vetro

Contenitori in plastica (250 mL) muniti di tappo

Connessione a Y




Calibrazione dell’energia di sonicazione

Accendere l’ultrasonicatore munito di sonotrodo cilindrico e impostare la potenza a 100 W. Immergere la punta del sonotrodo per 15 mm in un beaker contenente acqua e impostare lo strumento per cercare la frequenza di risonanza.

Sonicare l’acqua in modo da riscaldare il sonotrodo, quindi togliere il beaker ed asciugare il sonotrodo. Porre 500 g di acqua deionizzata in un recipiente metallico coibentato e preventivamente pesato, lasciare ad equilibrare e quindi misurare la temperatura dell’acqua. Immergere il sonotrodo per 15 mm nell’acqua cercando di isolare il più possibile il recipiente per evitare dispersioni di calore. Sonicare per 60 secondi e quindi misurare immediatamente la temperatura dell’acqua dopo appropriato rimescolamento. Calcolare la differenza in temperatura (T). Inoltre registrare l’output di energia (kJ) misurato dallo strumento alla fine della sonicazione. Raffreddare il recipiente sotto acqua corrente, risciacquare con H2O deionizzata e asciugare con carta da laboratorio. Ripetere l’intera operazione con tempi di sonicazione di 120, 300 e 600 s.

Per ciascun tempo di sonicazione calcolare l’energia (J) acquisita dall’H2O secondo la seguente equazione

Q = mw cw T

dove:


mw è la massa di acqua (g).

cw è la capacità termica specifica dell’acqua (4.18 J g-1 K-1).

T è l’aumento di temperature in seguito a sonicazione (K).

Dalla relazione lineare tra Q (kJ) e il tempo di sonicazione (s) è possibile ottenere la potenza di sonicazione che verrà applicata al suolo espressa in Watt (J s-1).
Separazione della POM libera (fPOM)

Pesare 25,0 g (< 2 mm) in un tubo da centrifuga da 500 mL precedentemente pesato. Aggiungere 125 mL (o 200 g) di una soluzione di sodio politungstato (NaPT) con densità di 1,6 g cm-3 (1:5 rapporto suolo:soluzione). Generalmente il volume totale di NaPT è aggiunto in 3 porzioni agitando leggermente tra un’aggiunta e l’altra. Agitare leggermente con la mano per 1 minuto controllando che tutto il suolo sia stato sospeso (usare una bacchetta di vetro se necessario), poi lasciare a riposo per 1 h.

Centrifugare per 20 minuti a 12800 g (8500 rpm) senza freno. Rimuovere la SOM particolata più grossa attaccata alle pareti del tubo da centrifuga o galleggianti sulla superficie della soluzione con una spatola di gomma e con l’aiuto di una spruzzetta riempita con NaPT a densità 1,6 g cm-3, depositarla su un filtro di microfibra di vetro 0,7 μm GF/F posizionato all’interno di un imbuto bückner. Decantare il surnatante contenente la fPOM galleggiante, facendolo passare sopra il suolo depositato sul fondo e sulle pareti del tubo e scendere nell’imbuto bückner (con la pompa a vuoto accesa). Rimuovere qualsiasi pezzo di SOM particolata attaccata alle pareti del tubo da centrifuga con una spatola di gomma e depositarla sul filtro.

Rimuovere il NaPT dalla beuta a vuoto, trasferirlo in un cilindro graduato, portare il volume a 125 mL (o 200 g) con nuovo NaPT (1,6 g cm-3) e riaggiungerlo a piccole dosi nel tubo da centrifuga, agitando, in modo da risospendere nuovamente il suolo. Lavare la fPOM con acqua deionizzata fino a che la conducibilità delle acque di lavaggio è < 20 μS cm-1 (circa 3-4 beute a vuoto di acqua deionizzata).

Trasferire la fPOM quantitativamente in un contenitore pre-pesato (minimo 50 mL) e far seccare in un forno ventilato a 45-50 °C. Pesare la frazione della fPOM ottenuta. Omogeneizzare la frazione con pestello e mortaio prima dell’analisi. Determinare il C e l’N contenuti nella frazione mediante analizzatore elementare
Separazione dell’oPOM

Dopo aver aggiunto 125 mL di NaPT nel tubo da centrifuga, ripesare e calcolare il volume totale di materiale (assumendo una densità di 2,65 g cm-3 per il suolo)*.

* (massa totale – peso tubo – peso suolo) = peso NaPT (g)

peso NaPT (g) /1,6 g mL-1 + peso suolo (g) / 2,65 g mL-1 = volume totale

Accendere il sonicatore, immergere la sonda nell’acqua e ricercare la frequenza di risonanza. Sonicare per 1 minuto l’acqua per riscaldare la sonda.

Mettere il tubo da centrifuga in un bagno freddo di acqua, immergere la sonda nella sospensione di circa 15 mm e sonicare per il tempo predeterminato** in modo da applicare l’energia corretta***.

** Volume totale (mL) * Energia (J/mL) = Energia totale (J)

Energia totale (J) / potenza di sonicazione (J/s) = tempo (secondi).

Lasciare a riposo per 30 minuti.

Centrifugare, decantare, filtrare e lavare la fazione della OPOM come descritto sopra per la FPOM.

Dopo aver separato la oPOM, il NaPT usato può essere ripulito per essere riciclato.

Trasferire la oPOM quantitativamente in un contenitore prepesato (50 mL) e metterla a seccare in un forno ventilato a 45-50 °C. Pesare la frazione della OPOM ottenuta. Omogeneizzare la frazione con pestello e mortaio prima dell’analisi.

Determinare il C e l’N contenuti nella frazione mediante analizzatore elementare.
***L’energia corretta viene determinata attraverso un pre-esperimento svolgendo le operazioni finora descritte su una serie di 3 campioni cui applicare valori di energia crescente (es. 100, 200, e 300 J mL-1). Dopo avere determinato il peso della frazione oPOM e il contenuto in C valutare qual è il valore di energia ottimale che ha permesso di ottenere la maggiore quantità di oPOM con la minima quantità di frazione minerale.
Separazione della sostanza organica associata alla fase minerale

Risospendere il rimanente suolo in acqua deionizzata, agitare per 5 minuti, centrifugare a 17700 × g (10.000 rpm) per 30 minuti (o più se la sospensione contiene un elevato quantitativo di minerali argillosi) e aspirare il supernatante facendo attenzione a non perdere la frazione minerale più fine. Ripetere il lavaggio almeno 5 volte, fino a che la conduttività del supernatante è < 50 μS cm-1. La sedimentazione diventa più difficile a mano a mano che la concentrazione ionica diminuisce. Pertanto sarà necessario centrifugare per un lasso di tempo maggiore a più basse temperature. Trasferire la frazione minerale quantitativamente in contenitori pre-pesati (100 mL) e liofilizzarla. Pesare la frazione minerale ottenuta. Omogeneizzare la frazione con pestello e mortaio prima dell’analisi.

Determinare il C e l’N contenuti nella frazione mediante analizzatore elementare.
Riciclo della soluzione di NaPT

Riciclare la soluzione di NaPT facendola passare attraverso una colonna di vetro sufficientemente larga, impaccata con carbone attivo (2 mm di maglia) con un flusso di 1mL min-1. Se la soluzione raccolta non è completamente limpida, filtrarla sotto vuoto utilizzando dei filtri di microfibra di vetro 0,7 μm GF/F posizionati all’interno di un imbuto bückner.

Mettere la soluzione in un forno ventilato a temperatura < 70 °C per concentrare la soluzione < 3 g cm-3 (1, 2 giorni). [Per essere sicuri di aver rimosso tutti i residui organici disciolti, prendere un’aliquota e seccarla per l’analisi elementare (deve esserci meno dello 0,02% di C)].

Prelevare 100 mL della soluzione concentrata di NaPT in un cilindro pre-pesato e pesarli. Basandosi sul peso e sulla concentrazione della soluzione di NaPT, calcolare quanta acqua deve essere addizionata al beaker per portare la densità della soluzione di NaPT a densità 1,6 g mL-1.

Se la densità è < 1,6 g cm-3 aggiungere NaPT secondo la formula:

NaPT [g] =1284·Densità – 1301

Se la densità è >1,6 g cm-3 aggiungere H2O deionizzata secondo la formula:

H2O [mL] =-284·Densità + 1300

Conservare la soluzione riciclata di NaPT in bottiglie di plastica (evitare di usare vetro).

Bibliografia

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